肿瘤特异性单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb，简称单抗)是应用杂交瘤技术针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体而制备出的MAb，可特异性识别肿瘤细胞抗原，选择性地摧毁肿瘤细胞而健康细胞基本不受影响，为肿瘤患者的靶向免疫治疗带来了希望。针对特定肿瘤抗原的MAb杀伤肿瘤靶细胞的机理主要有三个方面：①抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)溶解靶细胞；②通过补体依赖的细胞毒性(complement dependent cell cytotoxicity,CDC)；③直接和靶细胞结合促进肿瘤细胞凋亡。　　 ADCC被证明是MAb临床治疗肿瘤的重要机制和手段。MAb首先通过抗原结合部位与靶细胞(肿瘤细胞)结合，再由效应细胞上的FcγRⅢa识别其Fc段，介导ADCC作用。FcγRⅢa是唯一表达于NK细胞上可与IgG结合介导ADCC作用的Fc受体。FcγRⅢa有三种基因型：FcγRⅢla-158F/F，FcγRⅢa-158V/V及FcγRⅢa-158V/F。FcγRⅢa的多态性可影响NK细胞及单核细胞的ADCC效能。有研究认为FcγRⅢa-158V较FcγRⅢa-158F与人IgG结合具有更高的亲和力，可更有效介导ADCC作用，而具有更好的治疗效果。有研究报道FcγRⅢa-158V/V基因型病人，通过MAb治疗的疗效较FcγRⅢa-158V/F及FcγRⅢa-158F/F基因型病人好。　　 由于临床使用的肿瘤特异性MAb非常昂贵，其介导的ADCC抗肿瘤治疗的病人在治疗期间由于化疗所致的骨髓抑制、合并感染等原因，往往需静脉注射免疫球蛋白(IVIG)及血浆，上述治疗所提供的血清抗体和补体对ADCC抗肿瘤效应的影响尚不十分清楚，深入研究在肿瘤特异性MAb治疗应用过程中IVIG和血浆的配合应用十分重要。　　 本试验中尝试使用nest-PCR的方法检测出健康儿童及血液肿瘤患儿中FcγRⅢa的基因多态性的分布，了解血液肿瘤患儿对MAb可能的疗效反应；通过体外实验用利妥昔单抗介导不同FcγRⅢa基因型的NK细胞对高表达CD20的B细胞淋巴瘤细胞株(Raji细胞株)杀伤，确定不同FcγRⅢa基因型的NK细胞所介导ADCC效应的差异；并通过增加补体及血清抗体的方式体外检测它们对利妥昔单抗介导ADCC抗肿瘤作用影响。通过本研究希望对使用抗肿瘤特异性MAb的患者合理有效的应用IVIG和血浆提供指导意见及实验依据；这对提高肿瘤特异性MAb的临床疗效和改善肿瘤患者的生存率具重大意义。　　 第一部分、正常儿童及血液肿瘤患儿中FcγRⅢa基因多态性分布。　　 目的：检测健康儿童及血液肿瘤患儿中FcγRⅢa的基因多态性的分布，了解血液肿瘤患儿对MAb可能的疗效反应。　　 方法：　　 1.按照DNA提取试剂盒从收集的外周血标本中提取基因组DNA。　　 2.巢式PCR(nest-PCR)扩增FcγRⅢa基因：　　 (1)外侧PCR：外侧正义引物A为5'TGG CAA AGG CAG GAA GTA TT 3'，外侧反义引物B为5'GCG TGT AAG AAT CAG GAA TCT C 3'，25μL，反应体系包括DNA模板3μL，正反义引物A、B各2pmol，10 mmoL/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR缓冲液2.5μL。35个PCR循环(95℃ 45S，64℃ 45S，72℃ 30S)。扩增产物长度248 bp。　　 (2)内侧PCR：内侧正义引物C为5'ATC AGA TTC GAT CCT ACT TCT GCAGGG GGC AT 3'，内侧反义引物D为5'ACG TGC TGA GCT TGA GTGATGGTG ATG TTC AC3'。25 μL反应体系包括外侧PCR扩增产物1μL，正反义引物C、D各025 pmol，10 mmol/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR缓冲液2.5μL。35个PCR循环(95℃ 45 S，65℃ 45 S，72℃ 30 S)。扩增产物长度94bp。　　 3.NlaⅢ酶切鉴定FcγRⅢa基因多态性：8μL的PCR产物经NlaⅢ内切酶酶切，于37℃酶切过夜。酶切产物经15％PAGE电泳分离DNA片段，银染显色。FcγRⅢa-158V/V纯合型：PCR-RFLP后可得到61 bp和33 bp两个片段。FcγRⅢa-158 V/F杂合型：PCR-RFLP后可得到94 bp、61 bp和33 bp共3个片段。FcγRⅢa-158 F/F纯合型：PCR-RFLP后仍为94bp大小的片段。　　 4.统计分析：数据用SPSS16.0统计软件处理，各组之间基因型分布差异及等位基因分布差异采用卡方检验，检验水准设α=0.05。　　 结论：FcγRⅢa基因多态性在健康儿童及血液肿瘤患儿中的分布无明显差异，均以FcγRⅢa-158V/F最多，FcγRⅢa-158V/V次之，FcγRⅢa-158F/F最少。　　 第二部分、不同FcγRⅢa基因型的NK细胞对Raji细胞的ADCC效应的强度。　　 目的：确定不同FcγRⅢa基因型的NK细胞所介导的ADCC效应差异。　　 方法：　　 1.效应细胞分离：采用Ficoll-Hapaque分离外周血单个核细胞，行ADCC实验前流式细胞术检测其中CD3-CD56+的NK细胞的表达，以及NK细胞上FcγRⅢ的表达率。　　 2.靶细胞培养：高表达CD20的Raji细胞株作为靶细胞，行ADCC实验前流式细胞术检测其CD20表达率。　　 3.抗体：以利妥昔单抗作为ADCC反应抗体。　　 4.确定利妥昔单抗在下列ADCC实验中的合适作用浓度：在预实验中选用的利妥昔单抗的浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml等依次递增，与Raji细胞37℃作用30分钟后行分别用流式细胞术检测Raji上的CD20的表达，以其接近为零表达时的利妥昔单抗的浓度为最合适的作用浓度。　　 5.不同FcγRⅢa基因型的NK细胞的ADCC实验：取DIO标记的Raji细胞作为靶细胞，与利妥昔单抗于37℃培养箱中孵育30min，再加入PBMNC作为效应细胞，于体外37℃共孵育4小时，同样再加入荧光标记PI上流式细胞术检测，计算细胞毒性指数。　　 6.统计分析：数据用SPSS16.0统计软件处理，ADCC结果用均数±标准差表示，使用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)，检验水准设α=0.05。　　 结论：　　 1.在CD20+90％以上的Raji细胞1×106/ml中，30μg/ml的利妥昔单抗为最合适的体外实验作用浓度。　　 2.FcγRⅢa基因多态性可影响利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞的体外ADCC效应，以FcγRⅢa-158V/V基因型的NK细胞ADCC效应最强，FcγRⅢa-158V/F基因型的NK细胞ADCC效应次之。　　 第三部分、血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用的影响。　　 目的：体外检测血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用的影响。　　 方法：　　 1.效应细胞、靶细胞及反应抗体均与第二部分相同。　　 2.血清补体准备：采外周血5ml于干燥无菌离心管中，斜放试管静止30min后，2000rpm离心20min，用毛细吸管吸取上清(血清，含补体)-20℃冰箱保存，使用前与RPMI1640培养液1∶1混合，制成含50％人血清(含补体)的培养基。　　 3.血清抗体准备：采用上述方法分离血清，56℃水浴恒温箱30min灭活(其中补体失活，而抗体仍保持其活性)，-20℃冰箱保存，使用前与RPMI1640培养液2∶3混合，制成含40％人血清(含IgG)的培养基。　　 4.在行杀伤实验前，检测体外血清抗体对NK细胞上FcγRⅢa表达的影响。用含40％人血清(灭活后，含IgG约4.8mg/ml)的培养基将PBMNC调成5×106/mL，取100μL，置于5％CO2、37℃培养箱中孵育30min，拿出后PBS洗2次，流式细胞术检测加入血清前后NK细胞上FcγRⅢa的表达。　　 5.血清中抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用实验：取DIO标记的Raji细胞作为靶细胞，与利妥昔单抗(同时在血清抗体组加入40％人灭活血清)，于37℃培养箱中孵育30min，再加入PBMNC作为效应细胞(同时在补体组加入50％人未灭活血清)，于体外37℃共孵育4小时，再加入荧光标记PI上流式细胞术检测，计算细胞毒性指数。　　 6.统计分析：数据用SPSS16.0统计软件处理， 杀伤结果用均数±标准差表示，使用多因素方差分析和独立样本的t检验，检验水准设α=0.05。　　 结论：　　 1.血清补体可增强利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用。　　 2.血清抗体会减弱利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用。　　 3.使用肿瘤特异性MAb治疗肿瘤病人时，同时输注新鲜冰冻血浆可提高其抗肿瘤疗效；而MAb与IVIG同时使用则可能降低其抗肿瘤疗效。