前言：阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是以进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病。因其较高的发病率,日益受到社会重视,针对AD的研究和治疗也成为关注的热点。AD主要神经病理特征为细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积,细胞内神经原纤维的缠结(neurofibrillary tangles,NFT)及特定脑区胆碱能神经元的缺失。临床上,胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesteraseinhibitor,AchEI)是研究、开发较多,对症治疗效果较好的AD治疗药物,如多奈哌齐、加兰他敏、利伐斯的明、石杉碱甲。AchEI可以通过抑制突触间隙的胆碱酯酶(acetylcholinesterasem,AchE),延缓乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)的水解,改善胆碱能神经元的功能,从而改善认知能力。近来,AchEI的多靶向作用倍受关注。　　 在神经发育和维护中枢神经系统稳定性的过程中,经典的Wnt信号通路起到重要的作用。最近研究表明,Wnt信号的异常改变参与神经退行性疾病的调节,尤其是AchE和Aβ介导的毒性反应。在AD的老年斑中,可检测到AChE,AChE与Aβ可能形成AChE-Aβ复合物,增加Aβ的聚集和老年斑的形成。体内、外研究表明,与Aβ肽相比,AChE-Aβ复合物导致神经元死亡率更高。同时,研究发现Wnt信号通路的两个重要分子:糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β,GSK3β和β-连环蛋白(β-catenin)在AD小鼠脑内发生明显的改变,使用Wnt的激动剂可以保护海马神经元免受Aβ引起的毒性损伤。Wnt信号通路的激活可能会缓解AD胆碱能神经元的功能障碍。然而,AchEI的神经保护作用与Wnt/β-catenin信号通路作用的相关性,目前尚未阐明。　　 石杉碱甲(Huperzine A,HupA)是一种从中药蛇足石杉中提取的石松属生物碱,已用于神经退行性疾病的治疗。体内、外研究发现,除了能够抑制乙酰胆碱酯酶,HupA还能够明显减轻Aβ诱导的毒性,能够抗氧化应激、抗炎症反应,促进sAPPα的释放等其他的神经保护作用。　　 文献报道,与静脉注射法相比,HupA经鼻腔给药,药物在大鼠脑脊液中的浓度超出了静脉给药法。另外,经鼻腔给药还能避免肝脏的首过效应及肠道吸收坏境的影响,因此,鼻腔给药探讨能够为鼻-脑通道靶向给药提供实验依据。探讨HupA除了胆碱酯酶抑制作用和抗氧化作用外的其他神经保护作用,对于AD的多靶向治疗具有蕈要意义,同时,对Wnt信号通路的功能的进一步研究可能有利于了解AD的发病机制,从而为AD的治疗提供新的靶点。　　 方法：　　 1、HupA对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ淀粉样老年斑沉积的影响及其机制的研究采用C57BL/6小鼠,经鼻腔给HupA鼻凝胶剂处理,扫描电镜观察鼻纤毛,检测药物、剂型的安全性。以双转染人APP695swe基因和人早老素1(presenilin,PS1)AE9突变基因(APPswe/PS1△E9,APP/PS1)的6月龄小鼠(Jackson Laboratory,USA)为研究对象,鼻腔给予HupA鼻凝胶剂治疗4个月,应用免疫组织化学技术检测APP/PS1小鼠脑组织Aβ老年斑的分布;应用ELISA对APP/PS1小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42含量分析;RT-PCR检测APP/PS1小鼠脑内APP mRNA的表达;Western blot检测APP/PS1小鼠脑内APP代谢相关蛋白水解酶和水解产物的蛋白表达;免疫荧光共聚焦技术、体视学方法及Western blot技术检测HupA鼻凝胶剂对APP/PS1小鼠的脑内Wnt信号通路的影响。　　 2、HupA对转染人瑞典型突变APP(Swedish mutation APP,APPsw)的SH-SY5Y细胞APP代谢的影响及其机制的研究用HupA处理转染人APPsw的SH-SY5Y细胞,检测HupA对细胞APP代谢的影响,同时,使用Wnt、PKC抑制剂预处理细胞,对HupA影响APP水解的机制进行研究:Western blot检测APPsw细胞APP代谢及Wnt/β-catenin信号的蛋白水平;应用免疫荧光共聚焦技术检测APPsw细胞内Aβ和β-catenin的分布和表达。　　 结果：　　 一、鼻凝胶剂HupA经鼻腔给药的安全性　　 (一)扫描电镜观察结果显示,鼻凝胶剂及鼻凝胶剂HupA经鼻腔给药对小鼠鼻纤毛无明显的毒性作用。　　 (二)HupA鼻凝胶剂给药,对APP/PS1小鼠嗅球结构及嗅蛋白无明显影响。　　 (三)经HupA鼻凝胶剂处理,APP/PS1小鼠脑室下区的神经发生无明显改变。　　 (四)HupA鼻凝胶剂给药,对APP/PS1小鼠的血脑屏障无明显影响。　　 二、HupA鼻腔给药对APP/PS1小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的影响及抗氧化作用　　 (一)HupA鼻腔给药治疗降低APP/PS1小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的活性。　　 (二)HupA鼻腔给药治疗增强APP/PS1小鼠脑内胆碱乙酰基转移酶的活性。　　 (三)HupA鼻腔给药治疗增强APP/PS1小鼠脑内抗氧化酶的活性及减少氧化应激产物的产生。　　 三、HupA鼻腔给药对APP/PS1小鼠脑内APP代谢的调节　　 (一)HupA鼻腔给药治疗降低APP/PS1小鼠脑内APP蛋白水平,减少老年斑的生成。对APPmRNA的水平无影响。　　 (二)HupA鼻腔给药治疗增加APP/PS1小鼠脑内ADAM10的表达,减少BACE1及PS1的表达。　　 (三)HupA鼻腔给药治疗增加α-分泌酶水解产物sAPPα和C83的表达,减少β-分泌酶水解产物sAPPβ和C99的表达。　　 四、HupA鼻腔给药对APP/PS1小鼠脑内Wnt/β-catenin信号的影响　　 (一)HupA鼻腔给药治疗增加APP/PS1小鼠脑内磷酸化的糖原合成酶激酶-3α/β(p-GSK3α/β)水平。　　 (二)HupA鼻腔给药治疗稳定APP/PS1小鼠脑内β-连环蛋白(β-catenin)的表达,减少p-β-catenin的表达。　　 五、HupA对转染人APPsw的SH-SY5Y细胞APP代谢及Wnt/β-catenin的影响　　 (一)HupA增加转染人APPsw的SH-SY5Y细胞ADAM10的表达,减少BACE1的表达。　　 (二)HupA增加APPsw细胞α-分泌酶水解产物sAPPα和C83的表达,减少β-分泌酶水解产物sAPPβ和C99的表达。　　 (三)HupA能逆转PKC抑制剂及Wnt抑制剂对APPsw细胞的APP向非淀粉样代谢途径的抑制作用。　　 1、与用PKC抑制剂(Calphostin C)或Wnt抑制剂(DKK1)处理比较,HupA给药能够逆转抑制剂对ADAM10的抑制作用,降低BACE1的表达。　　 2、与用Calphostin C和DKK1比较,HupA处理,逆转Calphostin C和DKK1对APP裂解产物的调节,增加α裂解途径的裂解产物sAPPα和C83的表达。　　 (四)HupA逆转PKC抑制剂及Wnt抑制剂对APPsw细胞GSK3α/β的激活,稳定β-catenin水平。　　 与用Calphostin C或DKK1预处理比较,HupA处理能够逆转Calphostin C或DKK1对GSK3α/β的激活作用,增加β-catenin的表达。　　 结论：　　 1、HupA调节APP向非淀粉样途径代谢。　　 2、HupA鼻凝胶剂治疗APP/PS1小鼠,能够抑制APP/PS1小鼠脑内胆碱酯酶的活性、保护胆碱能神经元、有抗氧化作用;体内、外研究证实,HupA能通过激活Wnt/β-catenin信号调节APP的代谢。　　 3、HupA鼻凝胶剂治疗APP/PS1小鼠,APP/PS1小鼠未见明显的毒性反应,脑内老年斑减少,提示HupA鼻腔给药可能成为AD的非侵入性治疗策略。