背景和目的食管癌(esophageal carcinoma，EC)是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，其发生、发展是多因素、多阶段共同作用的结果。近年来，随着分子生物学的深入发展，对食管癌形成的分子生物学机制有了一定的认识，但其确切的发病机制仍有待进一步探索。研究表明，肿瘤在无新生肿瘤血管形成的微小实体瘤生长阶段，肿瘤细胞增长较快，必然导致局部缺氧。缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)正是在缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，是1992年semenza等在研究红细胞生成素(erythroprotein，EPO)基因表达时发现的，是由缺氧诱导的、连接在EPO基因缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)上的核因子，可调节几十种靶基因的转录，在肿瘤的血管生成、细胞生存、葡萄糖代谢、浸润、转移中发挥重要作用。Caspases蛋白是凋亡的执行蛋白，在其家族中Caspase-3处于蛋白酶级联反应的核心位置，它的失活或表达异常与多种肿瘤的发生发展有关。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，在成人已分化的正常组织不表达，而在大多数肿瘤组织中表达，并且其高表达与肿瘤生物学特性和预后密切相关。本研究应用免疫组织化学技术检测食管鳞癌、癌旁各级不典型增生组织、正常上皮组织中HIF-1α，Caspase-3，Survivin蛋白的表达情况与食管癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移的关系，以及它们在食管癌细胞凋亡中的相互关系。目的是探讨HIF-1α，Caspase-3，Survivin在食管癌的发生、发展、浸润、转移过程中的作用及有无相互关系，并为进一步探讨食管鳞癌发生、发展、浸润、转移机制及寻找抑制食管鳞癌发生、发展的途径提供理论基础。材料与方法1．标本：49例食管鳞癌组织标本收集自郑州大学第一附属医院2002年手术切除标本，所有病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。病理组织学证实49例食管癌均为鳞状细胞癌，其中Ⅰ级24例，Ⅱ级16例，Ⅲ级9例；淋巴结转移组23例，手术清扫的食管周围淋巴结中发现癌转移；无淋巴结转移组26例，食管周围淋巴结中未发现癌转移。浸润深度分两组。浅层组17例；深层组32例。每例标本均又取癌旁粘膜包括单纯增生上皮33例；轻度不典型增生19例；重度不典型增生14例，原位癌12例及正常食管上皮32例。2．试剂：一抗为稀释浓度分别为1：75和1：100的多克隆兔抗人HIF-1α和多克隆兔抗人caspase-3，均购自武汉博士德公司；稀释浓度为1：30的鼠抗人单克隆抗体survivin为北京中山公司产品，SP试剂盒为福建迈新生物公司产品。3．方法：应用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)SP法检测49例食管鳞癌中HIF-1α，Caspase-3，Survivin蛋白的表达。4．对照组设计阳性对照：用已知的HIF-1a阳性表达的肺腺癌组织做阳性对照；用已知阳性的乳腺癌组织做Caspase-3阳性对照；用已知阳性的乳腺癌组织做Survivin阳性对照，结果均为阳性。阴性对照：以正常羊血清代替一抗，结果阴性。空白对照：以PBS代替一抗，结果阴性5．结果判定：参考有关文献判断标准如下：根据染色程度及染色细胞百分率进行分析评定：0分：细胞无显色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。着色细胞占计数细胞的百分率：每张切片随机选取5个高倍视野，按阳性细胞数占同类细胞数的百分比，≤5％为0分，6％-25％为1分，26％-50％为2分，＞51％为3分。将每张切片染色程度与染色细胞百分率得分相乘的积为其最后得分。0-1分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(±)，4-6分为中等阳性(+)，＞6分为强阳性(++)。就其结果进行分析，将-、±合并为“-”，+、++合并为“+”，以简化数据处理。6．统计学处理：利用SPSS 11.0软件，两样本率的比较采用四格表资料的x2检验；多样本率的比较采用行×列表x~2检验；差异性分析用配对x~2检验；相关性检验用Spearman相关分析。检验水准α=0.05。结果1．HIF-1α蛋白在食管鳞癌组织中的阳性率为51.0％(25／49)，显著高于正常食管粘膜0％(0／32)(P＜0.05)；HIF-1α蛋白的阳性率随癌组织浸润程度的加深而增加，浅层浸润组和深层浸润组HIF-1α蛋白的阳性率分别为35.3％(6／17)和65.6％(21／32)差异具有统计学意义。有淋巴结转移组和无淋巴结转移组HIF-1α蛋白的表达率分别为73.9％(17／23)和38.5％(10／26)，差异有统计学意义；在癌旁粘膜中，从正常上皮组织、单纯增生组织、轻度不典型增生组织、重度不典型增生组织、原位癌到浸润癌，HIF-1α蛋白表达的阳性率呈逐渐增高趋势(其阳性率分别为0％、30.3％、31.6％、35.7％、41.7％、51％)，单纯增生、轻度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、浸润癌与正常上皮相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)；HIF-1α蛋白在癌组织中的表达随着癌组织分化程度的降低，阳性率逐渐增高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。2．Caspase-3蛋白在食管鳞癌组织中的阳性率为34.7％(17／49)，显著低于正常食管粘膜100％(32／32)(P＜0.05)；单纯增生组织、轻度不典型增生组织、重度不典型增生组织和原位癌组织中，Caspase-3蛋白的阳性率分别为75.8％(25／33)、63.2％(12／19)、57.1％(8／14)、66.7％(8／12)，与正常上皮比较均有统计学意义(P＜0.05)。在淋巴结转移组中的阳性率为17.4％(4／23)显著低于无淋巴结转移组(50.0％，13／26)(P＜0.05)；在浅层浸润组和深层浸润组中的阳性率分别为58.8％(10／17)、21.9％(7／32)，差异具有统计学意义(P＜0.05)；在癌组织中Caspase-3蛋白的阳性率随分化程度的降低而降低，但在统计学上没有意义(P＞0.05)。3．Survivin蛋白在32例正常上皮组织、33例单纯增生组织、19例轻度不典型增生组织、14例重度不典型增生组织、12例原位癌、49例浸润癌组织的表达，阳性率分别为6.3％(2／32)、9.1％(3／33)、31.6％(6／19)、50.0％(7／14)、58.3％(7／12)、57.1％(28／49)。轻度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、浸润癌和正常上皮组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，在食管癌组织浅层浸润组和深层浸润组中以及在有无淋巴结转移组中的表达均有差异(P＜0.05)。Survivin蛋白在各级癌组织中的表达没有差异(P＞0.05)。4．HIF-1α蛋白与caspase-3蛋白在食管鳞癌中的表达呈负相关关系，在27例HIF-1α蛋白表达阳性的病例中，有22例caspase-3蛋白表达阴性；在22例HIF-1α蛋白表达阴性的病例中，有12例caspase-3蛋白表达阳性。5．HIF-1α蛋白与survivin蛋白在食管鳞癌中的表达呈正相关关系。在27例HIF-1α蛋白表达阳性的病例中，20例survivin蛋白表达阳性；在22例HIF-1α蛋白表达阴性的病例中，14例survivin蛋白表达阴性。6．Caspase-3蛋白与Survivin蛋白在食管鳞癌中的表达呈负相关关系，在17例caspase-3蛋白表达阳性的病例中，有11例Survivin蛋白表达阴性；在32例caspase-3蛋白表达阴性的病例中，有22例Survivin蛋白表达阳性。结论1．HIF-1α蛋自在食管癌旁各级不典型增生组织中的阳性率逐渐增高，提示HIF-1α可能与食管癌的发生有关；HIF-1α蛋白在食管癌中的表达与浸润深度和淋巴结转移有关，提示HIF-1α蛋白与食管癌的浸润转移有关。2．HIF-1α蛋白在食管癌组织中的表达率随着癌组织分化程度的降低而呈逐渐增高的趋势，提示HIF-1α蛋白与食管癌的恶性进展有关。3．Caspase-3蛋白缺失或低表达与食管癌的发生及浸润转移有关。4．Survivin蛋白与食管癌的发生及浸润转移有关。5．HIF-1α蛋白的阳性表达与Caspase-3蛋白表达间呈负相关关系，与Survivin蛋白表达之间呈正相关关系，提示HIF-1α蛋白的阳性表达下调了Caspase-3蛋白的表达，使Survivin蛋白的表达率增加，使食管癌细胞凋亡受阻。联合检测HIF-1α、Caspase-3与Survivin可作为判断食管癌生物学行为的客观指标，对判断食管癌的预后具有重要意义。