研究背景与目的近几年来随着医学的发展,各种疾病的治疗手段不断创新,如造血干细胞移植术、器官移植术、肿瘤化疗术及导管置管术的广泛开展,广谱抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂的广泛应用,以及艾滋病人群的不断增加,致使条件致病真菌感染率不断上升。2003年北京协和医院统计的侵袭性真菌感染(Invasivefungal infection,IFI)发生率是20世纪九十年代的3.6倍,哈尔滨血液病肿瘤研究所2004年报道的血液病IFI发生率是上世纪末的4.0倍。目前临床上常见的深部真菌是念珠菌、曲霉菌、新隐球菌等。念珠菌约占40%～70%,而近年来曲霉菌感染率比往年有明显增高,在中性粒细胞缺乏和骨髓移植的患者中,侵袭性曲霉病(Invasive Aspergillus,IA)的感染率高达50%,是危害最大且预后最差的深部真菌感染,而且死亡率极高。其中烟曲霉是引起侵袭性曲霉菌感染中最常见而且致病性最强的菌种。探索早期、特异、敏感的快速诊断方法一直是曲霉菌感染研究领域的热点和难点。传统的诊断方法时间长,敏感性低,适用性差。目前人们把焦点集中到曲霉菌血清学和分子生物学的快速检测两个方面上。已有的血清学方法中,抗体检测法因患者存在免疫抑制,使抗体水平低不能反映患者的感染情况而受到限制。血液中抗原检测方法虽然有优势,但由于抗原量少以及方法学的不足未得到广泛开展。最近出现的半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)抗原检测的ELISA方法,具有很好的灵敏性,已在欧美国家广泛开展,但其价格昂贵,在国内广泛应用有一定困难。另外,在中性粒细胞缺乏的血液病患者中,存在抗原递呈功能和淋巴细胞功能损害,使得血清学试验(如半乳甘露聚糖试验等),丧失了诊断价值。分子生物学的发展为病原微生物的检测开辟了广阔前景,聚合酶连反应(polymerase chain reaction PCR)扩增和分子杂交分别是这些检测方法的基本技术之一,结合这两种技术我们设计了针对烟曲霉的种特异性引物并进行PCR扩增,将扩增的产物作为探针进行标记,标记好的探针与标本中提取的DNA进行斑点杂交,杂交结果阳性就可以确定有烟曲霉菌感染。以期建立一种能够早期、快速、敏感、特异、可供临床广泛开展的烟曲霉菌DNA检测方法。我们进行了如下研究:1.种特异性长链核苷酸探针杂交法的建立:在烟曲霉特异的碱性蛋白酶(alkaline protease,ALP)基因序列内设计引物,PCR合成一段465bp的DNA探针,并用地高辛标记,将烟曲霉、黄曲霉、念珠菌、隐球菌等真菌以及细菌DNA固定于带正电荷的尼龙膜上再与探针行斑点杂交,杂交结果阳性,可确定烟曲霉菌感染。2.大鼠侵袭性烟曲霉菌感染模型的建立:以烟曲霉制作感染大鼠模型,采集动物大鼠的血清及支气管肺泡灌液(BALF)标本并提取DNA,评价长链探针斑点杂交法在动物模型标本中的诊断价值。3.用斑点杂交法检测临床收集的侵袭性曲霉菌患者标本,评价斑点杂交技术在临床侵袭性曲霉菌感染诊断中的应用价值。研究方法1.烟曲霉菌种特异性探针的制备:真菌DNA的提取:DNA的提取采用CTAB法。烟曲霉种特异性探针(ALP)基因片段引物:上游引物5’-TCCGTGTACTTGATGGGTCT-3’下游引物5’-ATGTACGAGGATGTGAGCCG-3’引物参照文献报道的核苷酸序列。PCR扩增ALP基因、产物分析与测序:ALP基因经PCR扩增,扩增片段长度为465bp。产物经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察照相后切胶回收纯化,并进行测序,结果与GenBank提供的ALP基因文库序列号进行对比以确定其基因来源。2.探针的标记与斑点杂交:ALP基因片段经PCR扩增后用随机引物法进行地高辛标记,将烟曲霉、黄曲霉、念珠菌、隐球菌等真菌以及细菌DNA固定于带正电荷的尼龙膜上再与地高辛标记的探针行斑点杂交,杂交结果阳性,可确定有烟曲霉菌感染。3.侵袭性烟曲霉菌动物感染模型的建立:实验分组:72只SD大鼠分为三组,实验组48只,正常对照组及免疫抑制组各12只。免疫抑制及感染模型的建立:将实验组和免疫抑制对照组,分别给每只大鼠肌肉注射地塞米松0.6mg/kg,环磷酰胺75mg/kg,连续两天。在免疫抑制后第3天,实验组给予肌肉注射地塞米松0.6mg/kg后,将1×10~8/ml烟曲霉孢子混悬液缓慢滴入大鼠双鼻孔内,并使大鼠保持直立。每次滴入0.3～0.4 ml,1次/天,连续3天。免疫抑制对照组给予肌肉注射地塞米松0.6mg/kg,经双鼻孔滴入生理盐水0.3～0.4 m1,1次/天,连续3天。血清、肺泡灌洗液及内脏标本的采集及处理:实验组接种完成后1、3、5、7天分批心脏采血处死大鼠,正常对照组和免疫抑制对照组于第7天处死,收集大鼠的血清和肺泡灌洗液标本,-20℃下保存备用。无菌操作下,手术切取动物的肺、肝、脾等脏器,切取部分脏器组织制成匀浆,接种于沙氏平板上培养。其余内脏组织块放入10%福尔马林中固定8小时以上,石蜡包埋,并进行苏木素一伊红(HE)以及六胺银(PASM)染色。4.动物模型标本斑点杂交的检测:血清、肺泡灌洗液标本中真菌DNA的提取方法参照文献进行,将提取好的标本DNA固定于带正电荷的尼龙膜上,与标记好的烟曲霉长链核苷酸探针进行斑点杂交,实验组与对照组进行对比,斑点杂交法与BALF培养法进行比较。5.临床标本的收集及检测临床病例资料:临床曲霉菌感染高危患者12例,男8例,女4例,其中病理确诊2例,临床诊断4例,拟诊6例。收集上述患者的血清或肺泡灌洗液标本,低温冻存备用。用斑点杂交技术进行检测。6.统计分析方法:使用SPSS13.0统计软件,PearsonX2检验,多样本率的比较。实验结果1.烟曲霉碱性蛋白酶(ALP)特异性引物PCR扩增结果:用合成的烟曲霉特异的引物依次扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、白念珠菌、铜绿假单孢菌、人全血细胞DNA,扩增产物电泳,结果显示除烟曲霉扩增出1条465bp的特异条带外,其余真菌、细菌均未见特异性扩增带。结果表明该对引物对烟曲霉具有高度特异性。产物测序结果与基因文库登录号NC.007197.11为参照序列进行对比,相似度达99%。2.斑点杂交结果:杂交结果的特异性:提取的烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、乙肝病毒、人全血细胞DNA配制成10mg/ml,各取3μl分别点样于尼龙膜上,与地高辛标记的烟曲霉特异性探针进行杂交。此探针只与烟曲霉DNA杂交,与其它真菌、细菌DNA无交叉反应,结果表明此探针具有高度的特异性,杂交结果的敏感性:将提取的烟曲霉DNA倍比稀释分别点样于尼龙膜上,与烟曲霉探针杂交,最低可检出DNA的量为100fg,结果表明此探针有高度的敏感性。3.侵袭性感染模型的建立:脏器组织培养及血培养:实验组大鼠尸检见肝脏肿胀,表面见多个针尖大小的脓点,肺组织表面可见多个大小不等隆起的小结节,余内脏未见脓点及结节。脏器组织培养可见烟绿色菌落生长,质地呈绒毛状,背面呈淡黄色,镜下观察见有曲霉孢子和菌丝,菌丝呈条状有分隔分支呈45°锐角证实为烟曲霉。正常对照组和免疫抑制对照组:脏器培养均未见烟曲霉菌生长。血培养均未见真菌生长。脏器组织HE染色及PASM染色:实验组组织病理切片作HE染色,肺和肝组织可见组织内炎性细胞浸润,组织坏死,切片作六胺银(PASM)染色在坏死组织中可见成堆的菌丝,菌丝呈条状有分隔,分支为锐角。真菌组织学培养和组织病理切片六胺银染色证实为烟曲霉,侵袭性曲霉菌动物模型制作成功。正常对照组和免疫抑制对照组:脏器组织HE染色及PASM染色未见异常4.动物模型标本检测结果:将收集的血及肺泡灌洗标本提取DNA进行斑点杂交,实验组阳性率较正常对照组和免疫对照组高,P＜0.05,差异有统计学意义;随感染时间延长,阳性率逐渐上升,感染后第1天实验组杂交结果与免疫抑制和正常对照组差异均无显著性差异(P＞0.00625),感染后第3天血清标本与免疫抑制对照组也无显著性差异(P＞0.00625)。其余各组差异均有统计学意义(P＜0.00625)。总的灵敏度为67.6%,特异度为89.6%。1周内肺泡灌洗液斑点杂交法的总阳性率(68.8%)较培养阳性率(31.2%)高,差异有统计学意义(P＜0.05),特异度比较斑点杂交法(91.7%)低于肺泡灌洗液培养法(95.8%),但差异无统计学意义(P＞0.05)。血培养阳性率很低,但所需时间长不利于早期诊断。5.临床标本检测结果:在临床侵袭性曲霉菌感染高危患者12例中,经病理确诊曲霉菌感染2例,临床诊断曲霉菌感染4例,拟诊曲霉菌感染病例6例。将采集的血清和肺泡灌洗液标本提取DNA,用前两部分建立的斑点杂交法进行检测,检测结果有6例阳性。确诊曲霉菌感染病2例斑点杂交检测均为阳性。临床诊断的4例中有3例为阳性,6例拟诊病例有1例为阳性。其余病例标本经斑点杂交检测,结果均为阴性。研究结论1.成功建立了斑点杂交法检测曲霉菌感染技术:设计的烟曲霉种特异性探针对烟曲霉有高度的特异性,与其它真菌、细菌无交叉反应,此方法可以将曲霉菌鉴定到种的水平。且灵敏度高,最低可检测到100fg的真菌DNA.2.完成了斑点杂交法在侵袭性动物模型中临床效能的评价:成功建立经鼻孔滴入烟曲霉孢子建立动物感染模型,尸检脏器损害以肺、肝比较明显。斑点杂交法可以检测出模型动物血清及肺泡灌洗液中微量的真菌DNA,总的灵敏度为67.6%,特异度为89.6%。实验组阳性率明显高于对照组,斑点杂交法的阳性率高于培养法的阳性率。3.评价斑点杂交法的临床应用价值:在采集的临床高危患者标本中,确诊和临床诊断的患者标本,斑点杂交检测基本为阳性,拟诊病人的标本杂交结果阳性率较低。