疫苗是预防与治疗人类重大疾病的重要策略,也是现代生物技术药物的主要组成。抗原纯度高、针对性强、副反应少、制备简单的表位疫苗已成为现代疫苗发展的主流方向。然而,表位分子量小、结构简单、应答机制单一的生物学性质极大程度地限制了其免疫原性,并影响了该类疫苗的临床开发与应用。阿尔茨海默氏症(Alzheimer disease,AD)是一种致死的神经退行性疾病,其病理机制复杂,尚无法有效防治。近来,以β淀粉样蛋白(Amyloid β,Aβ)为靶标的免疫策略为AD的有效防治带来了希望,基于A β功能B细胞表位(Aβ1-15)开发的表位疫苗和抗体药物分布于临床前和临床研究的各个阶段。研究揭示;如何在保证免疫安全性的基础上有效提高表位多肽的免疫原性和保护功能仍是Aβ表位疫苗研发中急需解决的关键问题,也是表位疫苗开发的普遍需求。为此,本论文基于课题组前期工作基础,对以大肠杆菌左旋门冬酰胺酶Ⅱ(L-asparaginase B,AnsB)及通用型辅助 T 细胞表位(pan HLA-DR reactive epitope,PADRE)融合蛋白为载体设计和开发的新型Aβ表位疫苗进行了表达制备和初步免疫药理学研究。首先,论文对课题组前期设计并构建的新型表位疫苗抗原蛋白AnsB-PADRE-A β 1-15(简称APA)重组表达工程菌进行了复苏、培养和表达载体鉴定;进而,添加IPTG诱导抗原蛋白高效可溶性表达,并通过生物酶消化、超声波破碎、盐析沉淀、亲和柱层析和凝胶过滤等蛋白质工程技术手段对抗原蛋白进行了提取与分离纯化制备;再次,采用SDS-PAGE电泳分离、BCA法、凝胶柱层析、酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorhent assay,ELISA)和 Western-Blot 等技术方法对抗原蛋白的相对分子量、蛋白纯度、含量、同源自聚形式、抗原性以及表位可及性进行了系统鉴定;在此基础上,以野生型C57BL/6小鼠为实验对象,通过对抗血清中A β特异性抗体水平、抗体亲合力和IgG亚型等进行测定评价,进而比较性研究抗原蛋白与乳化佐剂(如弗氏佐剂)、颗粒性佐剂(如氢氧化铝佐剂)和核酸佐剂(如CpG寡核苷酸佐剂)等不同佐剂形式的组合效能,并从中甄选出最适疫苗组合方式。最后,以B6/J-Tg(APPswe,PSENdE9)/Nju(简称APP/PSN)转基因小鼠为AD病理模型,采用动物免疫、体液免疫检测以及基于水迷宫(Morris water maze,MWM)的学习记忆评价,对新型疫苗的免疫药理学效应进行初步研究。结果表明:通过工程菌的培养与诱导,论文实现了抗原蛋白在原核系统中的高效表达,并且主要以可溶性形式表达于细菌胞质中,利于抗原蛋白的正确折叠和纯化制备;经论文建立并优化的蛋白质纯化工艺,获得了纯度大于95%的目的抗原蛋白,证实了抗原蛋白单亚基相对分子量约为42 kDa,表观分子量约为164 kDa,并维持了融合表位A β 1-15的可及性和抗原性,揭示了抗原蛋白通过AnsB的自聚化过程形成了能够四价呈现A β1-15表位的同源四聚体分子;进一步基于野生型C57BL/6小鼠的体内研究显示制备获得的抗原蛋白与不同类型佐剂配伍时表现出不同的免疫应答强度和机制,其中与弗氏佐剂的组合在免疫原性和体液免疫偏向性等方面具有显著优势,能够诱导具有Aβ神经毒性中和作用和Aβ淀粉样斑块靶向识别的特异性体液免疫;在此基础上,本论文将抗原蛋白与弗氏佐剂的优化组合接种AD转基因模型小鼠APP/PSN,发现新型抗原在能够内源性表达Aβ的病理模型中表现出相对的免疫耐受,而具有神经保护作用的中药提取物TCME-1701能够克服耐受,在病理模型中诱导更为强烈的Th2型抗A β体液免疫,减轻病理小鼠的脑内淀粉样沉积,并在一定程度上改善模型小鼠的认知、学习及记忆能力。总之,本论文在课题组前期工作基础上,成功制备了以自聚化药用酶AnsB和通用型辅助T细胞表位PADRE融合蛋白为载体的新型四价Aβ表位疫苗抗原蛋白,证明了该抗原蛋白能够在野生型小鼠和AD转基因模型中诱导产生更为安全有效的Th2型抗Aβ特异性免疫应答,体现出有效防治AD的潜力,并揭示了自聚化药用酶AnsB和通用型辅助T细胞表位PADRE融合蛋白载体作为Th2型表位疫苗载体的可行性和实用性,为提升表位疫苗的免疫原性提供了一种新型的载体补充和技术方案,为AD的有效安全防治提供了一个候选抗原,并为基于相同免疫机制设计和开发的Aβ疫苗提供了一种潜在的辅助强化策略。