核糖体RMA基因间隔区ITS及IGS在真菌分子生物学 鉴定和分型中的应用 随看抗恶性肿瘤药物、免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛应用，器官移植和外科其他介入性治疗的深入开展，以及艾滋病(AIDS)的蔓延，真菌感染己经成为直接危害人类健康的潜在杀手。近年来，真菌感染出现了发病率不断增加、致死率和致残率不断增高、新的致病菌种和耐药菌株不断出现等特点。早期诊断真菌感染和采取特异性的抗真菌治疗措施成为挽救病人生命，提高患者生存质量的重要保障。 真菌的分类鉴定是一项浩大的系统工程。传统的真菌分类学主要依靠真菌的形态学、生理生化特点、抗原构造等特征。由于真菌的种类众多、个体多态性明显，因此传统的分类学指标常常会得出假阳性或假阴性结果，难以反映真菌的本质特点。在临床真菌实验室工作中不可避免地导致工作量巨大、耗时长、结论不明确等缺点。 近三十年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，真菌的分类学己经从表型分型进入了基因分型的新时代。目前应用于真菌分类研究的分子生物学技术主要包括以下几种：真菌基因组 DNA的 G+Cmol％含量的测定、核酸杂交(包括DNA—DNA杂交和DNA—RNA杂交)、染色体电泳核型分析(EK)、核糖分型、基因组 DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性 DNA分析(RAPD)、线粒体 DNA的限制性片段长度多态性分析、可溶性蛋白电泳、多位点酶电泳(MEE) 二 茗二军庚大学稼士毕业柱艾 中文荷要和核糖体RNA基因序列分析等。这些技术在真菌鉴定的分辨力强弱和分型性高低上各有不同。目前全球范围内的真菌分类研究工作者都在致力于寻找一种分型性高、分辨力强、重复性好、价格低廉的真菌基因分型手段。 在上述分型技术中，核糖体 RNA基因kRNA)序列分析被认为是最能反映物种之间遗传关系的指标之一，其原因在于：①核糖体是出现在所有细胞生物体中的一类常见细胞器，有着共同的遗传进化起源，因而可以提供包含所有真菌在内的遗传进化图谱，可比性强；②真菌基因组中编码核糖体的基因序列，有的片段如大小亚基核糖体RNA基因、5．8 S和5 S RNA基因，在进化上相对比较保守，不同真菌之间的同源性较强，可以作为亲缘关系较远的真菌如种、属和属以上真菌的鉴定指标；而有的片段如这些保守片段之间的间隔序列，在进化上相对变异大，亲缘关系接近的真菌之间差异也很显著，可以作为种、变种甚至菌株之间鉴别的依据。③核糖体是生物体内蛋白质合成与装配的场所，由于生物体对蛋白质的需要量的巨大，编码核糖体的基因处于不断转录和翻译的过程中，在单个生物体细胞基因组中，编码核糖体的基因占了相当大的比例，多个拷贝，在染色体上重复排列，相对与其它分子如线粒体来说，易于实验室抽提和提纯，具有相当大的实际可操作性。 以往对核糖体RNA基因的研究重点集中在保守的大、小亚基RNA基因序列，近几年来，越来越多的研究者发现大小亚基之间的基因间隔区由于可变性大，在真菌的高级别的分类学上的价值更高，可以提供属、种、变种甚至菌株之间的鉴别依据。核糖体基因间隔区可以分为内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)和基因内问隔区(intergenic spacer，IGS)2种。主要研究手段包括探针杂交、PCR扩增、限制性片段长度多态性分析门FLP)以及序列分析等技术。其中序列分析被认为是最直接、最明确的指标。以往由于DNA序列 2 — ———————————测定的工作量巨大和放射性危害等缺陷，获得大量的序列资料绝非易事。近年来随着以PCR为基础的DNA测序技术的拓展，使得DNA大规模测序成为分子生物学实验室的常规技术和操作，为真菌核糖体基因序列分析研究提供了切实的实验手段。 生物信息学(Bioinformatics)是近年来发展起来的一门由分子生物学和计算机信息处理技术相结合的交叉学科，它的基本出发点是利用数据库和软件技术对大量积累的生物大分子序列数据和实验测定的序列进行结构比较和统计学分析，推导出序列同源性，揭示出生物大分子的分子结构、功能和进化关系。目前在互连网上的DNA序列数据库主要有3家：美国国立卫生研究院全国生物技术中心(NCBI)的 GenBank数据库；欧洲生物信息研究所(EBI)的 EMBL数据库；日本国力遗传学研究所的DDBJ数据库。这些数据库资源共享、信息量巨大、每日更新，最为重要的是免费面向全球提供，成为科研人员不可或缺的资料库。当 1973年首次开展真菌大亚基核糖体基因序列研究时，GenBank中只保存了2条真菌(白念珠菌和新生隐球菌)的序?