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目前恶性肿瘤的治疗依然是困扰人类健康的头号难题。尽管我国前列腺癌的发病率相对欧美国家低,但随着国内人们生活水平的提高,人群寿命的延长,以及血清前列腺特异性抗原(Prostate specific antigene,PSA)筛查的逐渐普及,我国前列腺癌发病率也在逐年升高。特别是自2000年以来,我国前列腺癌的发病率以每年12.6%的速度急剧攀升,因此寻找防治前列腺癌的有效方法成为我们科研工作者一个亟待解决的难题。对于进展期前列腺癌,临床上的一线治疗方法依然是雄激素剥夺疗法(Adrogen Deprivation Therapy,ADT),但绝大部分患者在ADT治疗十几个月后都不可避免的进展为去势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)。这提示我们基础研究工作者需要多角度思考,阐明前列腺癌发生发展的分子机制,探寻特异性的治疗方法。近年来,科学研究工作者提出肿瘤细胞中存在一部分数目极少,但对肿瘤的增殖、迁移、侵袭、耐药、复发等有重要推动作用的亚细胞群,即肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC),又称癌干细胞/癌症干细胞。它们具有“自我更新”(Self-Renewal)及“多细胞分化”(Differentiation)的潜能。研究者发现前列腺癌中亦存在一种前列腺癌特异性干细胞(Prostataic Cancer Stem Cel,PrCSC),并认为它在前列腺癌进程和治疗抵抗中发挥重要作用。PrSC除了具有一般干细胞特性之外,生长不依赖雄激素,因此比其他肿瘤细胞对治疗具有更强的抵抗性。目前越来越多的证据表明,PrCSC极有可能是导致前列腺癌复发、转移和出现CRPC的根源之一,因而如何精准筛选出肿瘤干细胞,充分了解其起源、生物学特性,并寻找到专一性的药物靶向杀灭肿瘤干细胞成为前列腺癌的研究热点。CUL4B属于Cullin基因家族,它是泛素E3连接酶(Cullin-RING E3 Ubiquitin ligases,CRLs)的重要骨架蛋白,在细胞信号转导、周期调控、DNA损伤修复等方面发挥重要作用。我们的前期研究工作中发现CUL4B在前列腺癌组织中高表达,并促进前列腺癌的侵袭转移。在进一步研究中发现CUL4B可促进激素抵抗性C4-2B细胞的增殖,LNCaP细胞激素剥夺后CUL4B蛋白水平有短时表达下降,之后又逐步上升,提示CUL4B可能与CRPC进展有一定关联。有趣的是,CUL4B可促进雄激素受体(Adrogen Receptor,AR)的蛋白降解,并对AR通路下游相关基因调控作用不明显,因此需要探寻CUL4B促进CRPC进展的新思路。送检LNCaP细胞CUL4B敲减的表达谱芯片,生物信息分析发现CUL4B与前列腺癌干细胞发展明显相关,通过一系列干细胞功能实验发现CUL4B在体外具有促进肿瘤细胞成干的能力,提示CUL4B可能在前列腺癌细胞干性调控中发挥一定的作用。前期工作中,我们发现CUL4B在前列腺癌中可异常调控microRNA(miRNA),本研究中,通过送检miR-seq芯片发现CUL4B可以通过改变组蛋白修饰,从而抑制miR200b/c的表达,使miR200b/c的下游靶分子——BMI1蛋白水平表达增高,在促进前列腺癌干细胞样特性的进展与维持中发挥作用。综上,本研究提出了一条“CUL4B-miR200b/c-BMI1”调控轴模型,将CUL4B与前列腺癌进展相关的miRNA信号通路联系起来,并强调CUL4B在前列腺癌细胞干性调控中发挥作用。CUL4B可能在前列腺癌干细胞自我更新、维持中扮演着重要角色,从而为临床从干细胞治疗角度攻克前列腺癌疾病提供新的见解。研究目的:1、探究CUL4B在CRPC进展转化中的作用及可能机制2、分析CUL4B在前列腺癌中与干细胞特性的相关性3、检测CUL4B是否参与了前列腺癌干细胞的自我更新与维持4、探究CUL4B促进前列腺癌细胞干性调控的分子机制研究方法:第一部分探讨CUL4B在CRPC进展转化中的作用1 GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析 CUL4B 在 CRPC 中的表达2 Western Blot方法检测CUL4B蛋白在前列腺癌细胞系表达情况3慢病毒转染PC3、DU145细胞,用嘌呤霉素进行抗性筛选,构建前列腺癌稳定干扰/过表达CUL4B的PC3/DU145细胞,并在蛋白水平检测稳筛效率4通过贴壁细胞培养技术培养前列腺癌LNCaP细胞,瞬时转染NC/si4B,RNA、蛋白水平检测干扰效率,送检人类全基因组表达谱芯片5芯片结果利用GSEA分析检测CUL4B的相关差异表达基因富集情况6蛋白水平检测CUL4B在前列腺癌CRPC样特性细胞中的表达7检测CUL4B雄激素反应性8 CUL4B在CRPC转化过程中的表达变化9检测CUL4B对AR及下游相关基因的调控第二部分探究CUL4B在前列腺癌肿瘤干细胞干性调控中作用1 CUL4B敲减的基因组表达谱芯片运用GSEA分析检测与干细胞的相关性2微球形成实验(tumor sphere formation assay)检测PC3细胞稳定干扰CUL4B表达后,悬浮培养状态下形成微球大小及数量3 3D 微球实验(three dimension spheroid formation assay)检测 PC3 细胞稳定干扰CUL4B表达后,在含基质胶培养基内形成微球的大小和数量4 PC3、DU145稳筛细胞行克隆形成实验(Clone Formation Assay)检测CUL4B对前列腺癌细胞集落形成能力、自我更新能力的影响5 Western Blot检测CUL4B与前列腺癌干细胞相关标志物c-Myc,Oct4,Sox-2,BMI1,CD44表达相关性6送检基因表达谱芯片,通过GSEA分析寻找CUL4B可能下游作用靶基因,并在mRNA、蛋白水平验证7送检miRNA芯片,结合靶基因预测软件(miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan)和相关文献报道,选定CUL4B可能调控的miRNAs,并行RT-qPCR进行验证8 染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测CUL4B在miR200b/c的上游启动子区结合情况9 双荧光素酶实验检测miR200b、miR200c对BMI1的调控作用10 Western Blot 实验探究 miR200b、miR200c 是否参与了 CUL4B 对 BMI1的调控中研究结果:1、CUL4B在前列腺癌中可能与CRPC进展相关1.1与LNCaP细胞相比,CUL4B在激素抵抗性前列腺癌细胞LNCaP-AI和C42B中的表达显著升高1.2 CUL4B敲减的全基因组表达谱芯片运用GSEA分析发现CUL4B上调的基因富集于公共数据库GSE77763的CRPC表型1.3 LNCaP细胞在雄激素剥夺条件下,qPCR方法检测不同浓度/时间下双氢睾酮(DHT,Double Hydrogen Testosterone)刺激后,CUL4B的表达没有明显变化1.4 Western Blot实验检测CUL4B在LNCaP细胞激素剥夺不同时间后表达量有短时降低,之后升高并维持在高表达水平的变化1.5 qPCR检测发现CUL4B对AR下游相关基因PSA、TMPRESS2、KLK4的调控作用不明显2、CUL4B促进前列腺癌干细胞的干性调控与维持2.1、生物数据库及体外实验分析CUL4B在前列腺癌中与干细胞的相关性在与干细胞相关的公共数据库GSE19713分析中,CUL4B上调的基因富集于干细胞相关的表型上2.2克隆形成实验证实CUL4B促进PC3、DU145细胞的集落形成能力及自我更新能力2.3 CUL4B敲除的PC3细胞在无血清培养基悬浮培养的环境下,与对照相比形成微球的数量减少,并且相同时间形成微球的体积较小,成干能力减弱2.4 CUL4B敲除的PC3细胞在含有基质胶的无血清培养基内悬浮培养14天后,与对照相比单个细胞最终形成微球的数量减少,同时间形成微球的体积较小,成干能力减弱2.5 CUL4B促进前列腺癌干细胞相关指标c-Myc,Oct4,BMI1,CD44的表达3、CUL4B通过改变组蛋白修饰的方式抑制miR200b/c的表达,正相调控BMI1,进而促进前列腺癌细胞的干性调控3.1送检LNCaP细胞敲减CUL4B表达的基因表达谱芯片,利用GSEA富集分析,发现差异表达基因富集于BMI1、KRAS、RAPA、ATF2信号通路,其中BMI1分子与干细胞进展相关,筛选出的基因在mRNA、蛋白水平验证发现,BMI1在蛋白水平与CUL4B正相关,在mRNA水平未发现此关联3.2 MeV软件聚类分析发现CUL4B与BMI1表达水平正相关,P值小于0.00013.3 miRNA芯片分析显示,CUL4B敲减后上调的miRNA共947个,我们将上调的947个miRNA与4个靶基因预测软件miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan取交集,结合相关文献中已证实的调控BMI1的miRNA,最终筛选出miR128-3p、miR200b-3p、miR200c-3p、miR320a、miR183-5p、miR218-5p 这 6个microRNA,并进行qPCR验证,其中miR200b/c变化倍数最明显3.4 CHIP实验证实CUL4B可直接结合于miR200b的启动子区(S2、S3)和miR200c的启动子区(S1),直接调控miR200b/c研究结论:1、CUL4B可能与CRPC进展相关2、CUL4B与前列腺癌干细胞干性调控相关3、CUL4B可能通过“CUL4B-miR200b/c-BMI1”作用调控轴促进前列腺癌干细胞样特性的进展与维持