Oddi括约肌（sphincter of Oddi，SO）是包绕于胆管末端，具有自主舒缩功能的平滑肌结构，对控制胆汁流入十二指肠起到重要作用。已经证实胆固醇代谢紊乱是胆囊胆固醇结石形成的重要因素之一，而胆汁中过饱和的胆固醇结晶析出并形成结石的先决条件是胆囊排空功能障碍和胆汁的淤积。我们前期的研究结果证实，高胆固醇饮食饲喂新西兰兔可导致SO 舒张功能受损，即高胆固醇血症（hypercholesterolemia，HC）可诱发SO功能紊乱（sphincterof Oddi dysfunction，SOD），继而导致胆囊淤胆，为胆囊内胆固醇结晶的析出提供了适宜的内环境；进一步研究发现HC 兔SO 细胞内钙离子浓度（[Ca2+]I）过载可能是SOD发生的重要原因之一，而HC兔SO细胞[Ca2+]I 过载与细胞膜大电导钙敏感性钾离子通道（large conductance Ca2+-sensitive K+ channels，BKCa）的功能状态密切相关。但具体的机制尚不清楚。 BKCa通道在控制平滑肌张力及兴奋性方面起着重要作用，它是由结构性α亚基和调节性β1亚基共同组成的跨膜蛋白，其功能状态与α亚基和β1亚基表达水平密切相关。我们前期的研究已经证实HC兔SO细胞BKCa通道α亚基的表达量未见异常，由于β1亚基是BKCa通道的调节亚基，对于提高BKCa通道的Ca2+敏感性起到至关重要的作用，为此本课题第一部分内容采用RT-PCR 和Western blot 技术观察兔SO细胞BKCa通道β1亚基（BK-β1）基因在mRNA水平及蛋白水平的表达情况，进而采用全细胞膜片钳技术观察HC兔SO细胞BKCa 通道功能变化及对L型电压依赖性钙通道（L-type voltagedependent Ca2+ channels, L-VDCC）活性的影响。为了深入探讨兔SO细胞BK-β1基因的结构、功能以及表达调控，进而为分析BKCa通道功能与通道基因表型关系奠定基础，本课题第二部分内容目标是克隆并分析兔BKCa通道β1亚基（BK-β1）基因组及其启动子序列。本研究的主要结果如下： 1. 高胆固醇血症兔SO细胞BK-β1基因表达变化及对BKCa通道功能的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，HC兔SO细胞BK-β1基因在mRNA水平及蛋白水平表达量明显下调。全细胞膜片钳实验结果表明，HC兔SO细胞总K+电流密度明显降低（P < 0.05），BKCa 通道K+电流密度显著降低（P <0.05），同时KV通道K+电流密度也显著降低（P < 0.05），SO细胞的静息膜电位呈去极化改变，膜电容呈降低改变。与对照组相比，HC兔SO细胞L-VDCC钙电流密度明显升高（P < 0.05），但两组的稳态激活曲线、稳态失活曲线等通道动力学特征均无显著性改变。我们推测HC兔SO细胞BK-β1基因表达下调，导致BKCa通道功能降低，进而引发L-VDCC活性上调，这可能是HC诱发SOD的重要原因之一。 2. 兔BKCa通道β1亚基基因的克隆及特征分析 采用3及5-cDNA末端快速扩增（RACE）技术从兔SO组织扩增BK-β1基因全长cDNA序列（GenBank no. DQ821756），该基因cDNA全长为1408bp，由四个外显子组成，开放读窗（ORF）长度为576bp，编码191个氨基酸，其中第一外显子不编码；第二外显子包含24bp非编码区（UTR）并编码1-44个氨基酸；第三外显子编码45-102个氨基酸；第四外显子编码剩余的氨基酸（103-191）。 应用半定量RT-PCR技术观察BK-β1基因在兔SO、主动脉、肝脏、心肌、肺脏、骨骼肌、肾脏和脑组织中的分布，结果显示该基因在SO和主动脉等平滑肌组织中高表达，在心肌、骨骼肌以及脑组织的表达量明显低于平滑肌组织，在肝脏、肺脏和肾脏组织中未见表达。 采用LA-PCR方法扩增BK-β1基因内含子序列，三个内含子的长度分别为：第一内含子（intron 1）3175bp；第二内含子（intron 2）1442bp；第三内含子（intron 3）1704bp。结合该基因的cDNA序列，BK-β1基因组长度为7729bp，包含四个外显子和三个内含子，外显子/内含子接头序列均符合GT/AG的经典接头结构。Southern blot分析显示该基因在兔基因组中为单拷贝基因。 生物信息学分析表明兔BK-β1 基因编码的蛋白由两个跨膜螺旋和一段长的膜外段组成，具有4个功能结构域，含有1个PKA 磷酸化位点及2个N-糖基化位点。序列同源比对显示兔BK-β1基因在种属间具有很高的一致性。 3. 兔BKCa通道β1亚基基因启动子的克隆及特征分析 采用热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)方法，我们首次扩增了2021bp兔BK-β1基因上游侧翼序列，并提交到GenBanK（GenBank no. DQ839485）。在线生物信息学软件TESS分析显示，该区域缺乏典型的TATA-box和CAAT-box，但具有包括GC-box在内的多个转录因子结合位点。采用5′-RACE 方法确定该基因的转录起始位点（+1G），位于翻译起始位点（ATG）上游447bp处。以扩增的5′上游侧翼序列为模板，通过PCR方法构建不同长达的截短体，连入pGL3-basic报告基因载体中，得到一系列融合构建体（P-2001，P-763，P-271，P-93 和P-34），瞬时转染人胚肾293（HEK293）细胞，荧光素酶实验显示除了截短体P-34（-34/+30），其他截短体都具有较强的启动子活性。P-763（-763/+30）的荧光素酶活性较空载体高出40倍；P-93（-93/+30）相比P-34（-34/+30）表现出最大的荧光素酶活性差别，P-34的荧光素酶活性仅占P-93的25％。这说明P-93可能为最小的启动子活性区域，并且在-93/-34区域的GC-box可能对转录起始起着重要作用。 总之，本课题研究内容分为两部分。第一部分研究结果显示HC兔SO细胞BK-β1基因表达下调，导致BKCa通道功能降低，细胞膜处于去极化状态，致使L-VDCC关闭不全，细胞外Ca2+持续内流，这可能是导致SO细胞[Ca2+]I过载的重要原因之一。在第二部分内容中，我们首次从兔SO细胞扩增出BK-β1基因（GenBank accession nos. DQ821756 and DQ839485）及其启动子序列。该基因主要分布于平滑肌组织，为单拷贝基因，长度为7729bp，编码191个氨基酸，由四个外显子及三个内含子组成，与其他哺乳动物的该基因有很高的同源性。对于该基因启动子区域的分析表明该区域缺少典型的TATA-box，转录起始位点（+1G）位于翻译起始位点上游447bp，核心启动子为-93/+30，位于该区域的GC-box对转录起始可能起着重要作用。我们的工作为进一步研究兔BK-β1基因的表达调控提供了必备的基础。