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雷公藤(7ripterygium wilfordii.Hook.f.)是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Triptergium)的攀缘藤本植物,广泛分布于中国南方省份。其干燥根是传统的中药材,具有抗炎、抗菌、免疫调节、抗肿瘤及抗生育等多种作用。本课题应用ISSR和SRAP分子标记系统地研究了雷公藤种质资源的亲缘关系和遗传多样性,为合理开发和有效利用雷公藤资源提供了科学的指导和依据。主要研究结果如下:
1.确立了一套操作简单、实际可行的雷公藤DNA提取方法:采用“TIANGEN”植物基因组DNA提取试剂盒,对其提取方法进行优化提取样品DNA。获得了高质量的雷公藤基因组DNA。
2.通过对雷公藤ISSR和SRAP分析反应体系中主要影响因子进行优化,确立了这两种分子标记技术用于雷公藤种质资源研究时的最适宜反应条件。其中ISSR扩增条件为:20μL PCR反应体系含2μL10×PCR Buffer、20ng模板DNA、0.3mmol·L-1 dNTPs、0.4pmol·L-1引物、1.5U TaqDNA聚合酶、2.0mmol·L-1Mg2+。PCR扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s；54.7℃退火1min；72℃延伸1.5min;循环40次;72℃延伸7min,置4℃保存。SRAP扩增条件为:20μL PCR反应体系含2μL10×PCR Buffer、20ng模板DNA、0.2mmol·L-1 dNTPs、0.81μmol·L-1引物、1.0U TaqDNA聚合酶、2.0mmol·L-1 Mg2+。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,(94℃1min,35℃1min,72℃1.5min)5循环,(94℃1min,50℃1min,72℃1.5min)35循环,72℃延伸7min,置4℃保存。
3.本试验从100条ISSR随机引物中筛选出19条能够扩增出明显特异性条带的引物,对32份雷公藤种质进行分析,共扩增出127条清晰的ISSR标记条带,其中特异性条带109条,平均多态性比率为85.83％;从54种SRAP引物组合中筛选出19种能够扩增出清晰条带的SRAP引物,共扩增出150条DNA条带,其中多态性条带121条,平均多态性比率达80.67％。
4.32个种源按省份不同分为9个种群,由Nei’s遗传多样性分析结果表明,ISSR标记中9个种群之间的遗传多样性Ht=0.3126,种内遗传多样性Hs=0.1609,基因分化系数为Gst=0.4854,种群间基因流为Nm=0.5300。SRAP标记中9个种群之间的遗传多样性Ht=0.3174,种内遗传多样性HS=0.1602,基因分化系数为Gst=0.4952,种群间基因流为Nm=0.5096。由此可看出,种群间遗传变异与种内遗传变异所占比例相近；基因流较小(Nm<1),遗传漂变是群体遗传多样性的主要因素。
5.基于ISSR数据估计雷公藤种质材料的遗传相似系数(Gs)结果,32份雷公藤种质两两间的相似系数在0.3956-0.8750之间,平均为0.5696,利用UPGMA构建了32份雷公藤资源的聚类树状图,可将28份雷公藤种质分为三大类群(D=0.57处)或五大类群(D=0.53处)；基于SRAP数据估计种质材料的遗传相似系数(Gs)结果,32份雷公藤种质两两间的相似系数在0.4054—0.9528之间,平均为0.6124,利用UPGMA构建了32份雷公藤资源的聚类可将32份雷公藤种质分为2大类群(D=0.57处)或4大类群(D=0.53处)。
6.将ISSR和SRAP的遗传相似系数矩阵进行相关分析,ISSR与SRAP相关系数为0.4597,达到极显著水平。说明经过优化后的ISSR和SRAP技术较为稳定,表明应用这两种技术对雷公藤进行遗传多样性分析具有较高的一致性和可信度。
7.基于ISSR和SRAP混合数据估计雷公藤种质的遗传相似系数结果,32份雷公藤材料之间的遗传相似系数在0.4322-0.9022之间,平均为0.5827,处于ISSR和SRAP之间,但是差别不大。由供试材料的ISSR和SRAP标记数据混合后的聚类分析所绘出的树状聚类图,可将32份雷公藤种质分为2大类群(D=0.57处)或4大类群(D=0.53处)。这与ISSR和SRAP分析的结果甚为相似,但比较而言,与SRAP分析的结果更为相近。