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1、ART对子代小鼠一般生长情况的影响目的:对移植、超排、体外受精、卵母细胞体外成熟等最常用辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)的子代小鼠进行长期观察,分析比较不同ART对子代从出生到中老年期的一般生长发育情况的影响。方法:构建对照组(体内受孕+自然分娩,CON)及4组ART子代小鼠模型,包括移植组(体内受孕+胚胎输卵管移植,ET)、超排组(激素促排卵+体内受孕+胚胎输卵管移植,SO)、体外受精组(激素促排卵+体外受精+胚胎输卵管移植,IVF)和卵母细胞体外成熟组(卵母细胞体外成熟+体外受精+胚胎输卵管移植,IVM)。每周测量小鼠出生到40w体重、身长及尾长,并计算40w时的体重增长倍数及Lee’s指数。结果:1)与同性别对照组相比,各ART组小鼠的出生体重均具有降低的趋势,其中雄性IVF组及IVM组出生体重明显降低(P<0.05);各ART组小鼠的40w平均体重均超过了对照组,其中雄性IVM和雌性SO组40w体重显著增加(P<0.05);各ART组小鼠的体重增长倍数增加,其中雄性IVF和IVM组小鼠40w体重增长倍数显著提高(P=0.004);比较从出生到40周龄各组小鼠的体重增长曲线,各ART组的增加趋势大于对照组,其中雌性SO组与对照组和IVM组相比,体重增长曲线的变化趋势具有统计学差异。2)不同性别各组小鼠的出生身长和尾长均无差别;与同性别对照组相比,雄性IVF组和IVM组40w身长及尾长均增长(P<0.05);与SO组相比,雄性ET、IVF和IVM组40w身长明显较长,雄性IVF组40w尾长明显增长(P<0.05);雌、雄性小鼠ET、IVF及IVM组身长增长曲线的增长趋势,快于对照组;雄性小鼠IVF及IVM组尾长增长曲线的增长趋势,快于雄性对照组。3)SO组小鼠的Lee’s指数明显大于其他组,其中雄性SO组与对照、IVF和IVM组相比,雌性SO组与对照、ET、IVF和IVM组相比,40w Lee’s Index增大的程度具有统计学意义(P<0.05)。结论:ART技术使子代小鼠出生体重降低,但不影响其出生身长及尾长。低出生体重使得ART小鼠在出生后呈追赶式生长,在成年期使各ART小鼠体重超过正常出生小鼠。IVF与IVM子代小鼠的身长长于正常小鼠,因此成年期体重虽增加但未导致小鼠肥胖,而激素促排卵使子代在中老年期出现肥胖的现象。2、ART对子代小鼠中老年糖脂代谢情况的影响目的:通过比较ART子代小鼠中老年期的糖脂代谢状态,评价ART在糖脂代谢方面的中长期安全性,并分析其中可能导致糖脂代谢紊乱的关键操作,为临床ART的改进提供理论依据。方法:检测各组小鼠40w空腹血糖及腹腔葡萄糖耐量(Introperitoneal glucose tolerance test,IPGTT),计算IPGTT曲线下面积(area under the curve,AUC),分析小鼠血糖代谢能力;ELLSA方法检测空腹血清胰岛素并计算胰岛素抵抗指数(HOMA insulin resistance index,HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(insulin sensitive index,ISI)和胰岛素分泌指数(HOMA-β),分析胰岛素分泌和抵抗状态;检测空腹血脂(T-CHO、TG、HDL和LDL)水平,分析小鼠脂代谢状态。结果:1)雄性IVM及雌性SO组40w小鼠空腹血糖水平明显增高;与同性别对照组相比,40w雄性、雌性小鼠的SO及IVF组IPGTT AUC均明显增大,血糖代谢能力明显下降(P<0.05);与ET组相比,雄性IVF、雌性SO及IVF组的血糖代谢能力也均明显下降(P<0.05)。2)与同性别对照组相比,各ART组40w小鼠血清胰岛素水平具有增加的趋势,雄性SO及IVM组血清胰岛素水平明显升高(P<0.05);雌性ET、雌性和雄性小鼠SO、IVF及IVM组HOMA-IR明显增加(P<0.05);所有雌、雄ART组ISI均明显下降(P<0.05),胰岛素抵抗水平均明显增高;与同性别对照及ET组相比,雄性SO及IVF、雌性IVF及IVM小鼠的HOMA-β明显增加,β细胞分泌胰岛素能力提高,而雌性SO组的HOMA-β却明显减少(P<0.05),β细胞分泌胰岛素能力明显降低。3)与同性对照组相比,40w雌性SO组空腹血清T-CHO明显增高(P<0.05);雄性SO、IVF及IVM组、雌性SO及IVF组小鼠血清TG明显增高(P<0.05);雄性SO组LDL明显增高(P<0.05);雄性SO、IVF、雌性SO及IVM组血清HDL明显降低(P<0.05)。结论:ART技术使子代小鼠中老年期血糖代谢能力下降并出现胰岛素抵抗现象和脂代谢紊乱。不同ART技术引起的糖脂代谢紊乱的程度不同,其中ET组引起的糖脂代谢紊乱程度最轻,IVM组次之,而SO和IVF组程度最为严重。同时,ART对子代糖脂代谢的影响还具有性别差异性。3、初步探讨ART影响子代小鼠糖脂代谢能力的机制目的:通过检测子代小鼠血液、肝、肌肉、脂肪及胰腺等组织与糖脂代谢密切相关的印迹或非印迹基因的表达,及部分基因的甲基化状态,对相关机制进行初步探讨,为进一步阐明致病因素,防治疾病的发生、发展提供分子方面的实验依据。方法:ELLISA方法检测各组40w小鼠血清瘦素、脂联素水平,实时荧光定量PCR方法检测小鼠肝、肌肉、脂肪及胰腺组织与代谢相关基因H19/Igf2、Grb10、Dlk1、Mest、Serpinf1、及胰Nnat基因m RNA表达水平,Western-blot方法进一步检测相应蛋白表达水平,焦磷酸测序的方法检测代谢关键基因Nnat Cp G位点的甲基化水平。结果:1)与同性别对照组相比,ART各组小鼠血清瘦素水平无明显差异,雄性SO及雌性IVF组小鼠脂联素水平明显降低(P<0.05)。2)与同性别对照组相比,无论雌性或雄性小鼠,肌肉组织中SO及IVF组的Serpinf1基因的m RNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。3)与同性别对照组相比,脂肪组织中雌、雄性IVF及雌性IVM组H19 m RNA表达水平明显降低(P<0.05);雌、雄性小鼠的SO组Dlk1基因的m RNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)。4)与同性别对照组相比,肝组织中雄、雌性ET、SO及雌性IVF组H19 m RNA表达水平明显降低,具有显著的统计学差异(P<0.05);而雌、雄性IVM组的H19 m RNA表达水平明显升高(P<0.05);与对照组及移植组相比,SO、IVF及IVM组Igf2基因的m RNA表达水平明显升高,SO及IVF组IGF2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。5)与同性别对照组相比,胰腺雄、雌性ART各组H19、Grb10基因的m RNA表达水平均明显降低(P<0.05),但GRB10蛋白水平不具有差异;雄、雌性SO组的Serpinf1基因m RNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);雄、雌性SO、IVF及IVM组Nnat基因的m RNA表达水平明显升高,SO及IVF组的NNAT蛋白表达水平也明显增加(P<0.05)。SO组Nnat Cp G位点甲基化程度明显降低(P<0.01);其他四组间Nnat Cp G位点甲基化程度无差异。结论:ART子代成年后出现的糖脂代谢异常可能与细胞因子脂联素和SERPINF1,印迹基因H19/Igf2、Dlk1,尤其是代谢关键基因Nnat有密切关系,Nnat基因上游调控表达的Cp G岛甲基化程度降低可能参与到ART引起的基因表达水平改变的机制中。