卵巢癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤,死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中居首位,并有上升趋势。因卵巢生理解剖位置处于盆腔深部,早期卵巢癌患者缺乏典型的临床症状,大部分卵巢癌患者发现时病变已发展到晚期。因此在分子生物学水平研究卵巢癌变机理及恶性生物学行为,寻找早期诊断方法,探索有效的治疗手段,对于改善患者的预后,提高的生存率,降低死亡率有重要意义。本实验室前期应用SEREX技术从血清中筛选出卵巢癌相关抗原TIZ,TIZ蛋白在卵巢癌患者血清表达升高,TIZ蛋白联合其它血清标志物有助于提高诊断的敏感性和特异性。为了从基因水平进一步了解TIZ与卵巢癌的关系,本实验通过RT-PCR方法检测不同卵巢组织里TIZ基因的表达情况、构建TIZ基因真核表达载体及RNA干扰等实验,研究TIZ与卵巢癌的关系及TIZ对卵巢癌细胞系生物学功能的影响。卵巢恶性肿瘤组织中TIZ mRNA的表达及其临床价值目的:探讨TIZ基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法:采用RT-PCR技术检测48例卵巢恶性肿瘤、22例卵巢良性肿瘤及24例正常卵巢组织TIZ mRNA的表达情况,分析TIZ基因与卵巢癌的关系。结果:(1)TIZ mRNA在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢恶性肿瘤组织中均有表达。TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较正常卵巢组织低(p＜0.05),TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较卵巢良性肿瘤组织低(p＜0.05);(2)TIZ基因表达与卵巢癌患者组织学类型,病理分级等临床病理特征及预后无关(p＞0.05)。结论:TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中表达降低。TIZ基因与抑癌基因作用相同,有抑制卵巢癌的发生的作用。TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出TIZ基因全长,构建其真核表达载体。为进一步研究TIZ与卵巢癌的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板,提取人卵巢癌组织总mRNA,利用PCR技术进行TIZ基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,将连接载体进行酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出TIZ基因全长,并经测序验证其同源性达99%,测序结果显示第1551位的T突变成C,但其编码氨基酸并不改变,属无意义突变,可以用于后续实验研究。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出TIZ基因全长并构建了其真核表达载体pcDNA3.1-TIZ。真核转染TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学行为影响的研究目的:了解TIZ基因对卵巢癌细胞生物学功能的影响,分析TIZ在卵巢癌发生发展过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建TIZ基因真核表达载体后,将其转染入无TIZ基因表达的卵巢癌细胞株HO8910,G418筛选后经RT-PCR鉴定,确认获得稳定转染的HO8910/pcDNA3.1-TIZ细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、克隆形成能力、细胞迁移能力、黏附能力、细胞侵袭能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达TIZ蛋白的卵巢癌细胞株。生长曲线显示转染了TIZ基因的卵巢癌细胞株生长速度减慢。流式细胞仪对细胞检测结果显示HO8910/pcDNA3.1-TIZ组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.6%,G1期为67.4%,对照组则相应为60.7%和39.3%,其处于增殖周期的细胞减少。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力侵、袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,TIZ能够抑制卵巢癌HO8910细胞的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。RNA干扰TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学功能影响的研究目的:通过构建人TIZ基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验。方法:针对TIZ mRNA的不同区域设计三组不同的siRNA片段,脂质体法转染TIZ高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时荧光定量PCR检验干扰效率,选择干扰效率最高的siRNA片段构建干扰载体。脂质体法转染TIZ基因高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3并进行G418抗性筛选,获得稳转细胞株,RT-PCR检验TIZ基因受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同siRNA干扰片段的干扰效果进行检测结果显示,TIZ-573组相对拷贝数为0.844±0.756,与其他两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。TIZ-573组抑制率最高,其抑制率为61%。构建干扰载体pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,转染卵巢癌细胞系SKOV3,获得稳定干扰表达株SKOV3/pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,RT-PCR检验其TIZ mRNA表达明显减少。生长曲线显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组比对照组的细胞生长快。流式细胞仪对细胞检测结果显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为65.1%,G1期为34.9%,对照组则相应为36.6%和63.4%,其处于增殖周期的细胞增加。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力、侵袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,干扰TIZ表达能够增强卵巢癌细胞SKOV3的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。