论文部分内容阅读
背景:偏瘫型脑性瘫痪（hemiplegic cerebral palsy,HCP）约占脑性瘫痪（cerebral palsy,CP）的44%。强制性运动疗法（Constraint-induced movement therapy,CIMT）是治疗HCP手功能障碍的有效方法,然而其作用机制尚不明确。我们的预实验发现,CIMT可通过调控mi R-182-5p/Nogo-A轴来促进HCP小鼠的功能恢复和神经重塑,而c-Jun是mi R-182-5p的上游转录因子。研究表明,c-Jun作为独立的转录因子可促进中枢神经轴突再生。然而,尚不清楚c-Jun是否参与CIMT调控mi R-182-5p/Nogo-A以促进脑结构重塑。因此,本研究目的为通过制备HCP小鼠模型,并对其行CIMT干预,观察其干预前后HCP小鼠肢体功能的变化,以及c-Jun、mi R-182-5p和Nogo-A的表达情况,以探讨CIMT改善HCP小鼠肢体功能的作用机制,为CIMT的临床推广应用提供可靠的证据支持。方法:选取出生7天的C57BL/6小鼠进行实验,左颈总动脉结扎并缺氧两小时制备HCP模型,control组不进行结扎;术后1周所有小鼠做悬吊实验、平衡木实验,基于实验结果筛选HCP小鼠。根据是否进行CIMT和腺病毒注射分为:HCP+n CIMT组（放入丰富环境笼中饲养）、HCP+CIMT组（捆绑左前肢再放入丰富环境笼饲养）、高表达c-Jun组（HCP+lenti-c-Jun+n CIMT）、高表达c-Jun+CIMT组（HCP+lenti-c-Jun+CIMT）、低表达c-Jun+CIMT组（HCP+sh RNA-c-Jun+CIMT）。CIMT频率为8小时/天,5次/周,持续干预2周。CIMT结束后2周,再行悬吊实验和平衡木实验。随后将各组的小鼠灌注后进行脑部取材,通过RT-PCR测定各组小鼠mi R-182-5p、Nogo-A基因在血液的表达情况;采用透射电镜、免疫荧光和高尔基染色分别观察各组小鼠大脑运动皮层轴突及突触超微结构和形态、神经丝蛋白NF160、通路蛋白c-Jun、Nogo-A以及树突棘密度的改变情况;使用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较各组小鼠的组间差异。结果:（1）悬吊和平衡木实验结果显示,与control组相比,HCP+n CIMT组的前肢抓握能力和平衡协调能力显著降低（P<0.05）;（2）高尔基染色、透射电镜和NF160免疫荧光染色结果显示,HCP+n CIMT组髓鞘厚度、树突棘密度和NF160表达显著低于control组（P<0.05）;HCP+CIMT组小鼠大脑皮层髓鞘厚度、树突棘密度、神经丝的表达较HCP+n CIMT组均明显增加,其差异有统计学意义（P<0.05）;（3）Nogo-A,c-Jun免疫荧光染色结果显示,HCP+n CIMT组大脑皮层Nogo-A表达显著高于HCP+CIMT组（P<0.05）;（4）HCP+lenti-c-Jun+CIMT组小鼠大脑皮层Nogo-A的表达较HCP+sh RNA-c-Jun+CIMT组均明显升高（P<0.05）,HCP+lenti-c-Jun+CIMT组小鼠大脑皮层Nogo-A的表达较HCP+sh RNA-c-Jun+CIMT组均明显降低（P<0.05）;（5）RT-PCR的结果显示,与HCP+n CIMT组相比,HCP+CIMT中mi R-182-5p的表达水平有增加,但差异无统计学意义;与HCP+n CIMT相比,HCP+lenti-c-Jun+CIMT组中mi R-182-5p的表达水平明显升高（P<0.05）;HCP+lenti-c-Jun+CIMT组中mi R-182-5p的表达水平显著高于HCP+lenti-c-Jun+n CIMT组和HCP+sh RNA-c-Jun+CIMT组（P<0.05）。结论:CIMT可上调小鼠脑内c-Jun表达,上调mi R-182-5p,抑制Nogo-A表达,促进大脑组织结构的重塑,从而改善肢体运动功能,本研究为CIMT作用机制和临床精准治疗提供了有力的证据支持。