味觉信息是由味蕾接受并通过特定的内脏感觉神经（味觉神经）传入后脑的孤束核。在哺乳动物成年时期,这种特定的味觉神经的投射对其附属器官味蕾的维持性有着重要的意义。然而,在哺乳动物胚胎时期,关于味觉神经对味蕾的起始发生发育过程中所起的作用的研究,目前还存在着很大的争议。本论文以小鼠为研究对象,详细阐述了小鼠胚胎时期的味蕾发育过程,并证明了味蕾的发生发育是依赖于神经诱导的,与其成年时期的再生有着相同的分子机理。同时,本人对转录基因Foxg1对神经节形成过程中的作用进行了再研究。根据我的实验结果,本研究发现Foxg1对在膝状神经节中味觉神经元的分化有着决定性的作用,并由此修正了之前关于Foxg1对大脑神经节发育的相关影响的研究。这一新的发现不仅扩展了转录因子Foxg1在神经发育中的作用,同时也揭示了 Foxg1在感觉神经元中的表达对感觉器官（嗅上皮、耳板、视网膜和味蕾）的生理功能（嗅觉,听觉,视觉和味觉）有着至关重要的作用。论文概括Chapter Ⅰ外周味觉神经通路的组织及解剖学本章从解剖学的角度主要介绍了味觉附属器官（味蕾）和相应的外周味觉神经环路:味蕾主要分布于舌和软腭。味蕾主要有三大类:Fungiform,Circumvallate and Soft Palate taste organs.其中,Fungiform 主要分布在舌前 2/3处,其所接受的刺激经面神经（Ⅶ）传递至中枢神经系统;Circumvallate分布在舌后,其所接受到的味觉刺激由舌咽神经传递;第三种味蕾分布在soft palate表面,其所接受的刺激来由迷走神经（Great superior facial nerve,是Ⅶ中的一分支）传递。最终味觉信息经味觉感觉神经元的轴突投射在脑干后的孤束核。味蕾通常有四种受体细胞组成:Type Ⅰ细胞（类胶质细胞,为其它味觉受体细胞提供营养）,Type Ⅱ细胞（味觉受体细胞,接受甜、苦和鲜三种味觉刺激）,TypeⅢ细胞（接受酸味的刺激和内脏感觉神经末梢建立突触）和TypeⅣ细胞（基底细胞）。味蕾由两类感觉神经纤维介入:1)内脏感觉神经元,感受来自外界不同的味觉刺激并传入中枢神经系统。2)躯体感觉神经元,主要是感受疼痛和温度等刺激。Chapter 2外周味觉神经通路的发生味蕾由口腔表皮组织中的taste placode在胚胎发育阶段进行不断分裂和分化逐渐地形成的乳头状突起和味觉受体细胞所组成。本章节主要是从形态以及早期相关基因表达的角度来研究胚胎时期味蕾的发育过程并主要阐述了 1)味蕾形成过程中主要参与的三个信号通路（BMP pathway,Shh pathway,Wnt-βcatenin pathway,）及其相关的分子机制。2)味蕾再生的分子机理和味觉神经传导的相互关系及作用。3)目前,国内外关于味觉感觉神经元对味蕾的形成所起作用的研究现状。此外,本章还详细介绍了在外周神经系统中味觉神经元的个体发生过程以及相关味觉神经元的作用。对于哺乳动物而言,味觉神经元起源于原肠胚时期外胚层基板（geniculate placode）细胞迁移至颅内膝状神经节（Ⅶ,geniculate ganglion）并分化成具有特异性的味觉感觉神经细胞。这一类神经元细胞主要受Neurogenin2（Neurog2）,转录因子Phox2b和Foxg1的调控。通过分别敲出以上三种任意基因,味觉神经元的发育及功能就会发生障碍。本章节对Veurog2和Phox2b在味觉神经元中的分子机制做了详细的介绍,但目前,Foxg1在味觉感觉神经元中的作用还是未知。实验方法:1组织学方法以小鼠为实验动物模型,分别取其不同时期的胚胎（E12.5,E14.5和E20.5）进行解剖,将上颚与舌等组织放入4%的多聚甲醛中进行过夜固定。1)将解剖好的组织在15%的蔗糖溶液中浸泡,用含有15%蔗糖:7.5%明胶磷酸缓冲液在低温下（-40℃）对固定好的组织进行包埋。然后用冰冻切片机将其切割成20 μm的组织切片。或者2)用3%的琼脂糖凝胶对固定好的组织进行包埋。用振动切片机将其切割成100 μ m的组织切片。将制备好的切片进行免疫荧光和原位杂交实验。2 iDisco-Whole Mount immunostaining将多聚甲醛固定好的整块组织进行免疫荧光反应并做透明化处理。然后用激光共聚焦显微镜进行拍照。用imaris软件对得到的3D图像进行模型分析。具体实验步骤采纳于文献（Nicolas et al.,2015）3延长小鼠妊娠期对怀孕16.5天的B6D2小鼠注射100微升黄体酮（黄体酮:0.9%生理盐水=1:1）,在孕期第20.5天通过手术解剖的方法将小鼠体内的胚胎取出。3实验模型本论文中主要用到了 Neurogenin1,,Neurogen in2和Foxg1三种转基因小鼠系。本人博士期间的研究主要解决了两个问题:1)阐明味蕾的发育与味觉感觉神经元的相互关系,解决了二十多年来关于味觉感觉神经元对胚胎时期味蕾形成所起作用的争论。本研究已经整理成文章已准备投稿发表。2)研究转录因子Foxg1对Epibranchial ganglia的发育以功能性的作用并修正了先前的观点,阐明了基因Foxg1在特殊感觉神经元中的作用。一味蕾的形成依赖于味觉感觉神经元的诱导结果:1在胚胎时期,抑制Neurogenin1/2的表达并阻断味觉神经元对味蕾的投射味蕾所接收的外界味觉信息是由一级躯体感觉神经元（somatic sensory neuron）和内脏感觉神经元（visceral sensory neuron）接收并传输入中枢神经系统的孤束核。其中,躯体感觉神经元受Neurogenin1基因的调控,内脏感觉神经元受Neurogenin2基因的调控。通过实验,我首先验证了,Neurogenin（1/2）的缺失分别导致了躯体感觉和内脏感觉神经元无法投射到味蕾器官。我将 Neurogenin1 和 Neurongenin2 进 行 交 配 得 到 了Neurogenin1+/-;Neurogenin2+/-转基因小鼠。通过实验观察发现,在Neurogenin1-/-;Neurogenin2-/-小鼠胚胎中,在上颚后部以及舌部的味蕾不存在有任何感觉神经纤维的投射。2在上颚（soft palate）和2/3舌尖处的味蕾中的乳状突起结构（papillae）的形成与感觉神经元的投射无关以小鼠胚胎舌尖处的乳状突起结构（Fungiform papilla）为例,在胚胎发育第14.5天,从形态学的角度,此结构已经可以明显观察到。根据先前的研究,早期在此结构表达的相关基因有Shh,Sox2和Prox1,转录因子Mash1s6。利用Neurogenin1-/-;Neurogenin2-/-转基因小鼠胚胎（E14.5）为实验材料,在味觉感觉神经元无法形成的情况下,在分子水平上,我发现,这些早期基因的表达不受味觉感觉神经纤维的调控。这一结果,在上颚后部（soft palate）的味蕾处也得到了验证。因此,在上颚和2/3舌尖处的味蕾乳状突起结构的形成不依赖于味觉感觉神经纤维的诱导。3舌后部1/3处的味蕾中的乳状突起结构（circumvallate papilla）与味觉感觉神经元的投射的关系与其他部位的味蕾不相同的是,舌后部的味蕾的乳状突起结构,在没有味觉感觉神经纤维投射的情况下,早期基因Shh的表达受到抑制且表达量逐渐减少,其他基因Sox2和Prox1、转录因子Mash1和Hes6根本无法表达。通过形态学的观察,我发现,在没有感觉神经纤维的诱导下,此处的papilla结构无法形成。4味觉受体细胞的分化与味觉感觉神经纤维投射的关系味蕾最早形成与妊娠终止前后的口腔上颚后部。由于Neurogenin转基因小鼠体外无法存活,因此,本人以口腔上颚后部为主要研究对象。由于Neurogenin（1/2）基因缺失,有此基因缺陷的小鼠在母体外无法成活。通过黄体酮注射,使小鼠的发育在母体中由18.5天延续至20.5天。在第20.5天,通过Keratin8（K8）标记成熟的味蕾细胞,对比野生型小鼠上颚处,在Neurogenin2基因缺失的小鼠胚胎中（味蕾中没有一级内脏感觉神经元的投射）,通过统计学分析,成熟的味蕾在数目上减少了 88.9%。相对于野生型成熟的味蕾的表面积而言,对剩余被K8标记的细胞团簇减少了 88%。整体而言,在Neurogenin2突变体小鼠中,在上颚处只有1.7%K8标记的细胞团簇零星无规则地分布在上颚处。而在Nuerogenin1基因缺失的小鼠（味蕾中没有躯体感觉神经元的投射）中,味蕾的形成不受影响。同时,本人第一次发现,在第20.5天,一些标记味觉受体细胞特异性基因（KCNQ1,NTPNase2（TypⅠ 细胞）,Gustducin、Plcβ 2和 Trpm5（TypeⅡ细胞）,Pkd2l1（TypeⅢ细胞））在野生型小鼠上颚处已经开始了表达。对于Neurogenin2基因缺失的小鼠,上颚后半部所剩余1.7%的细胞无法表达以上基因。在Neurogenin1基因缺失的小鼠中,味蕾受体细胞可以表达上述味觉受体基因。因此,味蕾受体细胞的分化依赖于内脏感觉神经元而不是躯体感觉神经元的诱导。5味蕾的形成受内脏感觉神经纤维诱导的机理位于味蕾基底部具有再分化功能并表达SoX2基因的基底细胞,在正常发育的味蕾中,能够表达细胞增殖标记基因Ki67。而在缺失味觉内脏感觉神经纤维诱导的情况下,在口腔表皮,没有发现共同表达Sox2和Ki67的基底细胞。因此,Neurogenin2转基因小鼠中,味蕾基底细胞停止了增殖和分化,因此,无法形成味觉器官—味蕾。结论:A对于分布在舌尖的味蕾（Fungiform）和后颚的味蕾（soft palate）,其味蕾器官中的Papilla（即乳状突起结构）的形成与味觉感觉神经元的投射不相关。B对于分布在后舌1/3的味蕾（Wrcumvallate）,其pappilla（即乳状突起结构）的形成依赖于味觉感觉神经元的投射。C味觉受体细胞是由味觉感觉神经元诱导分化的。味觉受体细胞的形成完全依赖于内脏感觉神经元而不是躯体感觉神经元。D对于哺乳动物而言,胚胎时期味蕾的发育与幼体及成年时期味蕾的更新及再生的分子机制是相同的。胚胎时期味蕾的形成为后期味蕾的更新及再生提供了可能性。意义:味觉,这一重要的感觉,从生物进化的角度而言,对生命体在营养物质的摄取选择上起着重要的作用。本课题,在分子和细胞水平上,第一次通过活体实验证明了胚胎时期味觉感觉器官-味蕾的发育与味觉神经纤维传导的相互关系;解决了自1999年来关于味蕾发育是否受神经纤维诱导这一问题的争议;进而发现了特异性的内脏感觉神经元对味蕾基底细胞的增殖和分化具有维持和促进作用,统一了感觉器官味蕾胚胎时期的发育和后期的自主更新以及神经诱导性再生的机制;更重要的是,这一研究结果为探索味觉神经纤维对味蕾细胞发育所起诱导作用的分子机理的研究提供了科学依据。2转录因子Foxg1对味觉神经元的功能有着决定性作用结果:1小鼠胚胎时期,转录因子Foxg1在epipranchial placode和epibr anchial ganglia 中的表达。从小鼠胚胎E8.5起,转录因子Foxg1在Epibranchial placodes（Ⅶth,Ⅸth和Ⅹth）中表达。随着,该组织中的细胞不断增生、分化和迁移。Foxg1基因的表达量不断下降,最后特意地表达在epibranchial ganglia中某些特定内脏感觉神经元中。对比与野生型小鼠胚胎,Foxg1基因被敲出的小鼠胚胎的 epibranchial placode 异常高表达 Nueorgenin2。2转录因子Foxg1对小鼠颅神经节的形成与相应神经元的投射的关系在Foxg1-/-突变体小鼠胚胎中发现,与野生型相比,颅神经中的膝状神经节变小,且膝状神经节中的神经元的神经纤维投射发生异常:1)岩浅大神经（GSPN）神经纤维消失;2)Chorda tympani（CT）神经纤维束变细,有时消失;3)膝状神经节中的神经包体由沿神经纤维迁移的趋势。3转录因子Foxg1对膝状神经节在外周感觉神经器官的投射。膝状神经节中的神经元包体主要投射于味觉感觉神经器官味蕾处。本人发现,在Foxg1基因敲出的小鼠胚胎中,上颚失去了所有的感觉神经纤维的投射。在2/3舌尖部,味蕾中的感觉神经纤维束数目减少。进一步,通过将Neurogenin1转基因小鼠与Foxg1转基因小鼠想杂交得到的双敲出Neurogenin1-/-;Foxg1-/-的舌尖前部的感觉神经纤维束,相比野生型,数目减少了 74%。结论:A 转录因子 Foxg1 对 Epibranchial palacode 中的 progenitor cell 的增殖有影响。B转录因子Foxg1对膝状神经节（geniculate ganglion）的形成以及外周投射有着重要的作用。C转录因子Foxg1是味觉神经元发育的决定性转录因子。意义:本课题对于先前关于Foxg1在膝状神经节中的作用的研究进行了修正,并扩充了基因Foxg1在大脑神经发育中的作用。结合Foxg1在其他感觉器官中（嗅觉,听觉,视觉和味觉）的作用,Foxg1对感觉神经元的生理功能的发挥有着决定性作用。关于此课题,在接下来的博士后期间,本人将会对转录因子Foxg1在颅外周神经节中的功能进行进一步研究。借用测转录组的试验方法（Transcriptomic approach）,探索Foxg1与其他转录因子的联系,尝试去建立一个genetic cascade。