研究背景:我国现有的毒理学评价方法主要包括急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、致畸性和致癌性试验等,这些方法检测不到一些具有潜在的内分泌干扰作用的化学物。因此,尽快建立内分泌干扰物体内筛选评价体系,对保障人类健康和生态安全具有极其重要的意义。研究目的:初步建立内分泌干扰物哺乳动物体内筛选评价体系,并对联苯菊酯(BIF)的内分泌干扰作用进行研究,为我国制定最终的内分泌干扰物筛选评价指南提供科学依据。研究方法:一级筛选试验1.子宫增重试验:90只雌性SD大鼠随机分为9组,每组10只:溶剂对照组灌胃给予玉米油;BIF低、中、高剂量组分别灌胃给予1.47、4.41和13.23mg/kg bw/d的BIF; 17α-乙炔雌二醇(EE)经口阳性组灌胃给予1.0μg/kg bw/d的EE,EE经皮阳性组灌胃给予玉米油并皮下注射0.6μg/kg bw/d的EE。EE+BIF低、中、高剂量组,除灌胃给予相对应剂量BIF外,同时皮下注射0.6μg/kg bw/d的EE。连续给药3d后,称量大鼠子宫的湿重和干重,计算子宫系数,并观察子宫病理变化。2. Hershberger试验:90只去势雄性SD大鼠随机分为9组,每组10只:溶剂对照组灌胃给予玉米油;BIF低、中、高剂量组分别灌胃给予1.4、4.2、12.6mg/kg bw/d的BIF; TP+BIF低、中、高剂量组,除灌胃给予相对应剂量BIF外,同时皮下注射皮下注射0.2mg/kg bw/d的丙酸睾酮(TP);TP阳性组灌胃给予玉米油,并皮下注射0.2mg/kg bw/d的TP;氟他胺(FLU)阳性组灌胃给予3.0mg/kg bw/d的FLU,并皮下注射皮下注射0.2mg/kgbw/d的TP。连续给药10d后,称量腹侧前列腺(VP)、精囊腺和凝固腺(SVCG)、肛提肌加球海绵体肌(LABC)、阴茎头(GP)、尿道球腺(COW)、肝、肾和肾上腺的重量,计算其脏器系数,并测定血清中三碘甲腺原氨酸(TT3)和甲状腺素(TT4)水平。3.环青春期雌性大鼠甲状腺功能试验:70只雌性SD大鼠,随机分为7组,每组10只:溶剂对照组灌胃给予玉米油,BIF低、中、高剂量组分别灌胃给予1.1、3.3、9.9mg/kg bw/d的BIF, EE阳性组、三苯氧胺(TAM)阳性组和丙基硫氧嘧啶(PTU)阳性组分别灌胃给予0.005 mg/kg bw/d的EE、0.2 mg/kg bw/d的TAM和5.0mg/kg bw/d的PTU。从PND22开始给药,直至PND42。记录阴道开口年龄和体重。PND42,处死所有动物,称量子宫(湿重和干重)、卵巢、肝、肾、肾上腺、甲状腺(固定后)、垂体的重量,计算其脏器系数。并测定血清中TT3、TT4、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)和促甲状腺激素(TSH)水平。4.环青春期雄性大鼠甲状腺功能试验:70只雄性SD大鼠,随机分为7组,每组10只:溶剂对照组灌胃给予玉米油;BIF低、中、高剂量组分别灌胃给予1.4、4.2、12.6 mg/kg bw/d 的 BIF;甲基睾酮(MT)阳性组、FLU阳性组、PTU阳性组分别灌胃给予 80 mg/kg bw/d 的 MT、50 mg/kg bw/d 的 FLU、5.0mg/kg bw/d的PTU。从PND23开始给药,直至PND53。记录包皮分离年龄和体重。PND53,处死动物,称量VP、DP (背外侧前列腺)、SVCG、LABC、睾丸、附睾、肝、肾、肾上腺、甲状腺(固定后)、垂体的重量,计算其脏器系数。并测定血清中TT3、TT4、FT3、FT4 和 TSH 水平。二级检测试验一代繁殖扩展试验:100只雌性SD大鼠和100只雄性SD大鼠,随机平均分为4组(雌雄各25只/组):溶剂对照组给予正常饲料、BIF低、中、高剂量组经饲料给予1、3、9mg/kg bw/d的BIF。F0大鼠交配前2w开始给药,直至仔鼠PND21断乳。F1大鼠分为两组试验:F1a组经饲料给药至13w,F1b组经饲料给药至13w(PND90)后,换用正常饲料至17w(PND120)。1.F0大鼠:繁殖指标;仔鼠PND21刚断乳后,处死F0雌鼠和雄鼠,测定血清中TT3、TT4、FT3和FT4水平。称量大脑、垂体、甲状腺(固定后)、肝、肾、肾上腺、脾、胸腺、心脏、卵巢、子宫、精囊腺和凝固腺、前列腺、睾丸、附睾的重量,计算其脏器系数,并对这些脏器以及乳腺、阴道进行观察组织病理学检查。观察BIF高剂量组大鼠弓状核、腺垂体、睾丸和卵巢的超微结构。2. F1大鼠:繁殖指标;阴道开口时年龄和体重,包皮分离时年龄和体重。(1)F1a组:于第13w (PND90)处死动物,测定血清中TT3、TT4、FT3和FT4水平。称量大脑、垂体、甲状腺(固定后)、肝、肾、肾上腺、脾、胸腺、心脏、卵巢、子宫、精囊腺和凝固腺、前列腺、睾丸、附睾的重量,计算其脏器系数,并对这些脏器以及乳腺、阴道进行观察组织病理学检查。观察BIF高剂量组大鼠弓状核、腺垂体、睾丸和卵巢的超微结构。(2)F1b组:于第17w(PND120)处死动物。测定指标同F1a组。研究结果:一级筛选试验1.子宫增重试验:与溶剂对照组相比,EE经口阳性组和EE经皮阳性组子宫重量和子宫系数均显著增加;BIF高剂量组子宫湿重系数和干重系数显著增加。组织病理学检查发现,EE经口阳性组和EE经皮阳性组子宫内膜增厚、角化,子宫内膜上皮细胞高度显著增厚。BIF中、高剂量组子宫内膜增生、增厚,子宫内膜上皮细胞高度增高。2. Hershberger试验:TP阳性组,5种雄激素依赖性脏器(VP、SVCG、LABC、GP、COW)重量和脏器系数均显著增加,FLU阳性组均显著减轻。与溶剂对照组相比,BIF高剂量组TT3水平降低;与TP组相比,TP+BIF高剂量组VP、LABC重量显著减轻,TT3、TT4水平显著降低。3.环青春期雌性动物甲状腺功能试验:EE阳性组和TAM阳性组雌性大鼠阴道开口年龄显著提前,阴道开口时体重降低;EE阳性组雌性大鼠子宫重量增加,卵巢重量减轻;TAM阳性组雌性大鼠子宫和卵巢重量减轻。与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雌性大鼠使阴道开口年龄提前,BIF高剂量组体重明显降低。PTU阳性组雌性大鼠甲状腺重量明显增加,TT3、TT4、FT3、FT4水平明显降低,TSH水平升高。与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雌性大鼠TT4降低,TSH升高;BIF高剂量组TT3水平降低。4.环青春期雄性动物甲状腺功能试验:MT阳性组雄性大鼠包皮分离年龄明显提前,包皮分离时体重明显降低,SVCG、VP、DP、LABC重量显著升高,左侧睾丸、左侧附睾重量显著降低;FLU阳性组雄性大鼠包皮分离年龄推迟,包皮分离时体重明显增加,SVCG、VP、DP、LABC、左侧附睾重量均显著减少,左侧睾丸重量显著升高。与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雄性大鼠包皮分离年龄推迟,VP、DP、LABC重量显著降低。PTU阳性组雄性大鼠甲状腺重量明显增加,TT3、TT4、FT3、FT4水平显著降低,TSH水平升高。与溶剂对照组相比,BIF高剂量组甲状腺重量增加,TT3、TT4降低,TSH升高;BIF低剂量组TT4水平降低;BIF中剂量组TSH水平升高。二级检测试验一代繁殖扩展试验:1.F0大鼠:繁殖指标各组间无统计学差异。与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雌性大鼠肝、肾的相对重量显著升高;与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雄性大鼠SVCG、VP的绝对重量显著降低,大脑、肝、肾的相对重量显著升高。病理学检查发现,BIF各剂量组雌性大鼠乳腺发生病变,BIF中、高剂量组甲状腺滤泡增生;BIF各剂量组雄性大鼠前列腺发生病变,甲状腺滤泡增生。与溶剂对照组相比,BIF中剂量组雌性大鼠血清TT4水平显著降低,BIF高剂量组雌性大鼠TT3、TT4、FT3水平均显著降低;与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雄性大鼠血清TT3、TT4水平显著降低。BIF高剂量组大鼠弓状核、腺垂体、卵巢、睾丸的超微结构均发生改变。2. F1大鼠:繁殖指标各组间无统计学差异。与溶剂对照组相比,BIF各剂量组雌性大鼠阴道开口年龄均显著提前,BIF高剂量组阴道开口时体重显著降低;与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雄性大鼠包皮分离年龄推迟,BIF高剂量组包皮分离时体重增加。(1) F1a组:与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雌性大鼠卵巢绝对重量显著降低,大脑、肝、肾的相对重量显著增加;与溶剂对照组相比,BIF中剂量组雄性大鼠VP重量降低;BIF高剂量组雄性大鼠终末体重明显降低,大脑、肝的绝对重量显著增加,大脑、垂体、甲状腺、肝、肾和肾上腺的相对重量均显著升高,VP的绝对重量和相对重量显著降低。病理学检查发现,BIF中、高剂量组雌性大鼠可见甲状腺滤泡增生;雄性大鼠BIF各剂量组均可见前列腺病变,甲状腺滤泡增生,垂体可见去雄不育细胞。与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雌性大鼠TT3、TT4、FT3水平均显著降低,BIF高剂量组FT4水平显著降低;与溶剂对照组相比,BIF低剂量组雄性大鼠FT3水平降低,BIF中、高剂量组雄性大鼠TT3、TT4、FT3水平均显著降低。BIF高剂量组大鼠弓状核、腺垂体、卵巢、睾丸的超微结构均发生改变。(2) F1b组:与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雌性大鼠卵巢绝对重量显著降低,大脑、肝、肾的相对重量显著升高;与溶剂对照组相比,BIF高剂量组雄性大鼠VP绝对重量显著减低,大脑、肝、肾的相对重量显著升高。病理学检查发现,雌性大鼠BIF高剂量组可见甲状腺滤泡增生;雄性大鼠BIF各剂量组均可见前列腺病变,甲状腺滤泡增生,BIF中、高剂量组垂体可见去雄不育细胞。与溶剂对照组相比,BIF中剂量组雌性大鼠FT3水平降低,BIF高剂量组TT4、FT3、FT4均显著降低;与溶剂对照组相比,BIF中、高剂量组雄性大鼠TT3、FT3水平均显著降低;BIF高剂量组TT4、FT4水平也显著降低。BIF高剂量组大鼠弓状核、腺垂体、卵巢、睾丸的超微结构均发生改变。研究结论:一级筛选试验1.子宫增重试验:可用于筛选类雌激素或抗雌激素作用的物质。阳性受试物EE具有雌激素作用;BIF可能具有类雌激素作用。2. Herhsberger试验:可用于筛选类雄激素或抗雄激素效应以及抗甲状腺激素作用物质。阳性物受试物TP具有雄激素作用,FLU具有抗雄激素作用;BIF可能有抗雄激素效应和抗甲状腺激素作用。3.环青春期雌性大鼠甲状腺功能试验:可用于筛选类雌激素、抗雌激素或抗甲状腺激素作用的物质。阳性受试物EE具有雌激素作用,TAM具有抗雌激素和部分雌激素作用,PTU具有抗甲状腺激素作用;BIF可能具有雌激素和抗甲状腺激素的作用。4.环青春期雄性大鼠甲状腺功能试验:可用于筛选类雄激素、抗雄激素或抗甲状腺激素作用的物质。阳性受试物MT具有雄激素作用,FLU具有抗雄激素作用;BIF可能具有抗雄激素和抗甲状腺激素的作用。一级筛选试验结论:BIF可能具有类雌激素、抗雄激素和抗甲状腺激素作用。二级检测试验一代繁殖扩展试验:更明确地确定和描述受试物对内分泌系统的潜在危害。通过一代繁殖扩展试验表明BIF具有雌激素、抗雄激素和抗甲状腺激素的影响,对内分泌系统有干扰作用。可逆性试验显示,动物的中毒症状有明显的恢复作用,但是内分泌干扰作用的可逆性并不明显。在本试验条件下,BIF的最低有作用剂量LOAEL=1.0mg/kg bw/d。通过本研究建议内分泌干扰物哺乳动物体内筛选评价体系为:注:1. 一级筛选结果阳性则进入二级检测试验;2. Hershberger试验可加测甲状腺激素指标,用于筛选具有抗甲状腺激素活性的物质。