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甜菜M14品系是远缘杂交得到的二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)染色体组上附加野生白花甜菜(B.corolliflora Zoss.)第9号染色体的单体附加系,具有抗盐、抗旱、耐寒和无融合生殖等野生品种的优良性状,是发掘甜菜优质基因的重要资源。课题组前期采用i TRAQ LC-MS/MS技术获得甜菜M14品系盐应答(0、200、400m M Na Cl)差异表达蛋白质,利用Hiseq 2000高通量测序技术构建了盐胁迫下(0、200、400m M Na Cl)甜菜M14品系叶片和根的转录组数据库。从已经构建的盐胁迫RNAseq数据库中获得丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(Bv M14-STPK)c DNA全长,并进行了生物信息学分析。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶既可以催化底物蛋白发生磷酸化,也可以催化自身发生磷酸化,从而启动该激酶的酶活,引起下游的级联反应,参与细胞信号的转导过程。本试验主要从以下两个方面研究甜菜M14品系Bv M14-STPK基因对盐胁迫的应答作用。首先,我们研究了Bv M14-STPK基因对盐胁迫的应答反应。构建了带有FLAG标签的植物重组表达载体p CAMBIA1300S-Bv M14-STPK-3x FLAG,转化拟南芥野生型植株(WT)和拟南芥STPK基因突变植株(KO),分别获得拟南芥Bv M14-STPK基因阳性过表达植株(OX)及拟南芥Bv M14-STPK基因阳性恢复植株(CO)。以野生型WT植株和突变的KO植株为对照,对过表达的OX植株和恢复的CO植株在不同盐胁迫下进行了表型、生理生化水平及蛋白水平的检测。同时,以野生型WT植株作为对照,对过表达的OX植株和恢复的CO植株在不同盐胁迫下进行了转录水平的检测。结果如下:1、以野生型WT植株作为对照,过表达的OX植株在150m M Na Cl胁迫后根长、鲜重及干重差异均显著;以突变的KO植株作为对照,恢复的CO植株在150m M Na Cl胁迫后根长、鲜重及干重差异均显著。这说明Bv M14-STPK基因的过表达可以增加转基因植株的生物量,进一步证明该基因在植物的生长发育过程中起着重要的作用。2、以野生型WT植株作为对照,过表达的OX植株在150m M Na Cl胁迫后叶片电导率、叶绿素含量及K~+、Na~+含量差异均显著;以突变的KO植株作为对照,恢复的CO植株在150m M Na Cl胁迫后叶片电导率、叶绿素含量及K~+、Na~+含量差异均显著。这说明Bv M14-STPK基因在盐胁迫下对植株的细胞膜稳定性、植株的光合作用及植株的K~+、Na~+平衡均起到了重要的作用。3、利用Real-time PCR技术以野生型WT植株作为对照,检测150m M Na Cl胁迫前后过表达的OX植株及恢复的CO植株STPK基因的表达量变化,结果显示,以野生型WT植株作为对照,过表达的OX植株及恢复的CO植株在150m M Na Cl胁迫后STPK基因的表达量差异均显著。这说明Bv M14-STPK基因在植物抗盐过程中具有应答作用。4、为了测定Bv M14-STPK激酶酶活的专一性,利用FLAG标签纯化出150m M Na Cl胁迫前后的Bv M14-STPK激酶并测定该激酶的酶活。以0m M Na Cl处理作为对照,通过测定150m M Na Cl胁迫后过表达的OX植株及恢复的CO植株Bv M14-STPK酶活发现,恢复的CO植株胁迫前后的酶活性不如过表达的OX植株胁迫前后的酶活性差异显著,这说明Bv M14-STPK激酶的活性增加,从而参与蛋白的磷酸化反应,进而增加了植株对盐的抵抗能力。其次,为了探究盐胁迫对Bv M14-STPK蛋白磷酸化位点所产生的影响及磷酸化位点变化对该激酶酶活所产生的影响,将构建好的重组植物表达载体p CAMBIA1300S-Bv M14-STPK-3x FLAG转入到烟草中,利用FLAG标签获得该基因的表达蛋白Bv M14-STPK,用高效液相色谱串联质谱技术探究盐胁迫对该基因表达Bv M14-STPK蛋白的磷酸化位点所产生的影响。结果发现,0m M Na Cl处理下,共鉴定出13个丝氨酸位点和8个苏氨酸位点有磷酸化。而在150m M Na Cl处理下,共鉴定出14个丝氨酸位点和7个苏氨酸位点有磷酸化。进一步比较发现150m M Na Cl处理后,第75位Thr磷酸化位点消失,第497位Ser磷酸化位点新增。这说明盐胁迫能够使Bv M14-STPK蛋白的磷酸化位点发生变化。为了探究Bv M14-STPK蛋白磷酸化位点变化对该激酶酶活所产生的影响,又分别对0m M Na Cl处理及150m M Na Cl处理下的酶活进行检测,结果发现150m M Na Cl处理后,Bv M14-STPK激酶的酶活性增加。酶活性的变化是由第75位的Thr磷酸化位点消失引起的,还是由第497位Ser磷酸化位点新增引起的,或是由两个位点的相互作用而使酶活性发生改变,我们将在后续实验中继续探究。