骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种好发青少年的恶性骨肿瘤,占恶性骨肿瘤住院病人的35～44%,因其恶性程度高、转移早,疗效差,一直是临床骨科医生研究的难点、焦点和热点。随着新辅助化疗的积极开展、配合积极的手术治疗(如保肢手术的开展),使骨肉瘤的生存质量和预后明显改观,国外五年生存率已达到了80%以上;国内因为肺部及远处转移、局部复发和化疗、放疗的严重毒副作用和并发症,以及耐药问题等而使治疗效果尚不乐观,即使在比较好的骨肿瘤治疗中心,虽已有明显进步,五年生存率也只在60%左右,与国外相比仍有不小的差距。寻求一种经济、安全、行之有效、毒副作用小或者可以减少或降低现有药物剂量的方法用于骨肉瘤的治疗已成为患者、临床医生、生物学家和药物学家们共同的愿望。随着分子生物学技术、免疫技术的迅速发展,人们现在对肿瘤的生物治疗寄予厚望。免疫治疗,基因治疗和微生物纯化产物治疗肿瘤正成为目前和将来研究和应用临床的热点。 微生物病原体能引起人类和动物体内恶性肿瘤的退变已有若干报道。早期认为主要是病原微生物能在缺氧的肿瘤生长区域内繁殖,并在感染机体的过程中通过刺激宿主免疫系统,而抑制肿瘤生长。牛型分枝杆菌疫苗Calmette-Guerin在临床上广泛应用于浅表膀胱癌的局部治疗就是这方面一个很好的例子。同样,Salmouella菌能以肿瘤细胞为靶细胞,激活肿瘤细胞的免疫反应而常作为疫苗载体用于癌症的预防。实验中人们还发现,患有肿瘤的鼠在减毒活性鼠伤寒沙门浙江大学博士研究生论文氏菌感染后,瘤体发生退变缩小。因此认为:病原微生物可导致机体巨噬细胞和淋巴细胞的活化,产生抗肿瘤活性的细胞毒因子。厌氧菌被认为能在肿瘤厌氧中心优势生长。Oang等报道厌氧菌和选择性化疗及抗血管生成因子联合应用,使小鼠体内的5.C.肿瘤明显缩小,并把这种方法称为:Combination ba。triolyti。therapy(COBALT)。然而活菌因其产生明显的毒性和副作用限制了其在人类肿瘤治疗中的应用。近来Hunter等实验发现,感染T,gondii的患有黑色素瘤的小鼠虽然肿瘤缩小,但并没有激活T细胞和NK细胞,也没有巨噬细胞产生的NO(Nitricoxide)或工L一2片断和TNF一Q。但却发现在感染过程中,产生了一些能抑制血管生成的可溶性抗血.管生成因子-一类似于内源性血管生成抑制剂endostatin,从而造成肿瘤组织缺氧而最终使肿瘤细胞坏死。故认为此点可能具有潜在的治疗价值。 有关细菌治疗肿瘤的大量研究工作主要是运用活菌本身或其产物(混合物)来治疗肿瘤,使肿瘤局部造成缺氧的环境或通过激发机体产生免疫反应而达到治疗肿瘤或控制瘤体生长的目的。但因其缺乏特异性和针对性,且毒性大,副作用大,难以推广研究和临床应用。 近年Yamada研究由假单胞细菌分泌、在体内和体外荷瘤裸鼠实验中可诱导黑色素细胞瘤、单核巨噬细胞凋亡的细菌氧化还原含铜蛋白一AZUR工N时,发现野生型AZURIN在恶性黑色素瘤中有明显地诱导肿瘤细胞凋亡、使活体肿瘤缩小且无明显毒副作用。这一发现为活菌产物小分子纯化蛋白抗肿瘤增殖、诱导肿瘤细胞凋亡从而应用于临床治疗肿瘤带来了希望和前景。作为一种诱导凋亡药物,它的作用在乳腺癌细胞中己被实验所证实,同时我们在骨肉瘤体外细胞学初步实验中发现:AZURIN可选择性的抑制骨肉瘤U20S细胞的增殖,诱导骨肉瘤细胞的凋亡。 在本研究中,我们构建了含AZURIN基因的尸QE3O载体,通过原核表达获得AZURIN纯化蛋白,探讨AZUR工N对人骨肉瘤的凋亡诱导和抑制增殖作用。 实验分两部分浙汀大学博士研究生论文 第一部分:可溶性细菌氧化还原蛋白AZUR工N分子的克隆、表达、纯化及抗肿瘤 活性鉴定 根据Genbank中的假单胞菌(PSetldomonas aeruginosa)细菌氧化还原蛋白 AZURIN的序列,采用计算机辅助程序设计引物,在上游引物中插入BamHI限制性 酶切位点,在下游引物中插入Pstl限制性酶切位点。用PCR方法由假单胞菌 (ps“udomo“as aeruginosa)染色体DNA扩增AzuRIN基因片段,通过T一A克隆酶切 鉴定及全自动正反向测序分析,将目的基因融合插入原核表达载体PQE30中,并 在M巧大肠杆菌表达可溶性的AZURIN蛋白,质粒酶切鉴定和测序分析及western blot检测抗6 X his一tage抗体和抗一AzUR工N多克隆抗体均证实获得了目的蛋白 AZURIN.经纯化和复性后,用重组融合蛋白AZURIN诱导人骨肉瘤U20S细胞,通过 MTT法、Hoechest33258荧光染色法及倒置显微镜观察凋亡细胞;流式细胞仪分析 细胞周期、凋亡率、线粒体膜电位变化和DNA断裂实验检测细胞增殖和细胞凋亡 情况。研究可溶性细菌氧化还原蛋白AZURIN对人骨肉瘤U20S细胞的生长抑制效应 及凋亡诱导作用。结果获得的重组蛋白AzuRIN的蛋白纯度达99.1%以上。用 50一ZOOmg/L的蛋白诱导人骨肉瘤UZOS细胞12h以上细胞的生长和增殖即被显著 抑制,并且观察到典型的凋亡细胞、凋亡小体、凋亡峰及 DNA的片段化等凋亡的 特征性变化,线粒体跨膜电位(△平耐随着AZURIN作用的时间和浓度的增加而逐 渐降低,细胞的生长抑制率与凋亡率也呈剂量依赖和时间依赖关系。 第二部分Fas抗原和casePase一3,8调控AZuRIN诱导的人骨肉瘤细胞凋亡的实