目的:颌面部的骨组织损伤和缺损不仅会直接造成颜面部畸形而影响美观,还会导致病患在发音、语言、咀嚼以及呼吸等方面出现一定程度的功能障碍。目前,临床治疗当中所采用的自体或异体组织移植虽有较好疗效,但却仍旧存在不可忽视的弊端。因此,骨组织工程的提出为解决这一临床问题提供了新的思路。骨组织工程学是将组织修复材料和具有生物活性的物质进行结合,借由生物因子等发挥作用来促使骨组织修复。目前,骨组织工程己逐渐发展成为通过对细胞支架材料与生物活性因子联合使用,促进骨组织的修复、再生,最终使缺损的骨组织得以修复或重建。此种方法的优点在于不受限于供体的来源,不具有免疫排斥问题,修复重建后的组织可以替代原有组织,并具有较为理想的功能。纳米羟基磷灰石(nHA)晶体的粒径处于1-100nm范围内,具有良好的表面能与量子效应,且在降解性和生物活性方面亦性能优良,更加易于和骨组织发生整合,加强骨的机械性能与骨传导特性。以nHA晶粒植入机体内部不会对机体造成病理性损害,并且能够通过相互连通的孔隙来促进组织液微循环,从而促使新生骨质与周围组织发生结合。明胶(Gel)来自于生物体的本身,是胶原在发生了部分水解后所产生的变性产物,在医学领域之中有着十分广泛的应用。明胶的来源非常广泛、易于获得;有着良好的生物相容性与生物可降解性。相比于胶原,明胶具有更少的抗原性,并且其分子链中所含有的丰富氨基酸能够增加细胞的识别位点,促使种子细胞黏附于其上。传统工艺通常直接将生长因子加入支架材料中,此类制备方式常会导致生长因子在短时间内就出现大量而迅速的释放,使得生长因子作用时间短、且局部因子浓度过高,因而对种子细胞的作用往往是弊大于利。明胶微球(GMS)属于缓释给药系统中的一员,不仅能够使药物自载体中释放的速度得到延缓,而且可以对载于其中的生长因子起到保护作用。单一的人工骨替代物通常仅能够发挥骨传导的作用,缺少骨诱导性。针对这一不足,可以将具备良好生物相容性、骨传导性以及可降解性的生物支架材料和具有良好成骨诱导活性的生长因子相结合,从而能够兼具骨传导与骨诱导的双重特性。骨组织缺损的修复重建是一个有多种类型细胞因子参与、调控的复杂而精密过程,任何一类生长因子在骨形成过程中都并非完全独立地发挥作用,而是和其他生长因子相互影响和协调,一同形成有机的调节网络,共同参与调控骨的修复过程。因而越来越多的学者选择将两种生长因子进行联合应用,以期达到更好的骨组织再生效果。骨形态发生蛋白-6(BMP-6)作为BMPs中BMP-7亚型的一员,能够诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)进行成骨定向分化。血小板衍生生长因子(PDGF)作为多种细胞的有丝分裂刺激源,能够对间充质干细胞和成骨细胞等发挥趋化作用,也是目前作用最强的骨生长因子之一。PDGF能够促使受损区域的骨形成细胞发生募集和迁移,促进细胞的分裂增殖以及分化,并对局部血液循环的重建发挥着十分重要的功能。本实验通过构建能够双缓释PDGF、BMP-6的纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架,探讨其理化、生物学性能,并将支架材料与大鼠BMMSCs相复合用于颅骨临界骨缺损的修复,以此评估该复合型支架材料用于骨组织工程的应用效果。研究方法:1、以改良乳化交联法、直接分散+真空冷冻干燥法制备明胶微球以及纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架。2、万能力学测试仪对支架进行机械强度测试。3、以称重法和介质浸泡法分别对支架材料的吸水率和孔隙率进行检测,利用扫描电镜观察支架结构并测定支架孔径。4、利用全骨髓贴壁法大鼠骨髓间充质干细胞的体外提取、分离和培养。5、大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志物鉴定。6、骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导分化及鉴定。7、通过体外细胞毒性试验、溶血试验、皮内反应试验、热原试验、急性全身毒性试验、局部植入反应试验以及亚慢性全身毒性试验来对支架材料的生物安全性进行检测。8、将细胞接种于支架并通过早期黏附率、细胞增殖率、扫描电镜和激光共聚焦显微镜来判断支架的细胞相容性。9、构建载双因子支架并测定因子的体外释放情况。10、对接种于支架上的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导培养,检测成骨诱导后细胞的ALP活性及利用Western Blot检测相关蛋白的表达变化,对复合支架对细胞的成骨相关机制进行初探。11、SD大鼠的颅骨临界骨缺损模型的制备以及不同组别支架材料的植入。12、手术后影像学以及组织学检测。13、实验数据的统计学分析。结果:1、构建纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架所需纳米羟基磷灰石的最适比例为20wt%,经扫描电镜观察支架材料侧壁的粗糙度有利于细胞黏附其上。2、实验中提取的大鼠骨髓间充质干细胞经检测可知其表型稳定、纯度较高,具有良好的活性以及多向分化潜能。3、通过体外生物安全性能检测,结果显示本实验构建的复合支架材料不具有细胞毒性、致热性以及致敏性,不会引起实验动物出现急慢性机体损伤,且与细胞复合培养显示,细胞在支架上具有很好的黏附和增殖能力,细胞形态良好。4、实验中构建的缓释双因子的复合支架经Elisa试剂盒检测,结果显示于体外释放14天后,PDGF的累积释放量为95.213±2.461%;于第18天BMP-6的累积释放量为97.037±1.863%,且释放曲线呈现较为平和缓慢的上升趋势,提示包裹于明胶微球中的因子能够实现一定程度上的缓释。5、经细胞接种并进行成骨诱导后,相关检测显示双缓释PDGF和BMP-6的支架能够促使细胞ALP活性及骨钙蛋白表达增高,成骨相关的通路蛋白Akt的磷酸化水平升高,当向培养体系内加入PI3K抑制剂后,OCN的表达量出现减少但并未完全受到抑制。6、经8周的SD大鼠临界颅骨缺损修复实验,术后放射线及组织学检测对比,双缓释PDGF、BMP-6的纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架体现出了良好的促成骨特性及生物相容性,此结果与体外实验结果相符合。结论:1、本实验成功构建了双缓释PDGF、BMP-6的纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架,当纳米羟基磷灰石添加量为20%时,作为骨组织工程材料性能最佳。2、纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架具有良好的生物学性能及机械强度,符合骨组织工程对支架材料的要求,在动物体内未见出现明显的刺激反应,能够作为细胞支架用于骨组织缺损的修复。3、缓释PDGF、BMP-6的纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架在体外能够促进BMMSCs的成骨分化;支架的促成骨作用与PDGF诱导的成骨通路蛋白Akt的磷酸化水平升高存在相关性;PDGF与BMP-6在促进成骨方面存在协同作用。4、利用缓释PDGF、BMP-6的纳米羟基磷灰石/明胶-明胶微球支架修复大鼠颅骨缺损,结果证实了该复合支架材料有显著的促成骨效应,可以作为组织工程方法修复骨缺损的选择方式。