本论文研究工作为国家重点基础研究发展计划(973计划)项目：基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究——“藻戟遂芫俱战草”配伍关系与毒效表征的基础研究中部分研究内容。论文共分四个章节讨论,各章节的主要内容和研究结果如下：一、文献研究本部分对古今相关文献进行梳理归纳,系统综述了芫花与甘草配伍禁忌的形成源流以及配伍的物质基础、生物效应、临床应用等现代研究进展,在此基础上设计了本论文的研究思路与实验方案。二、芫花-甘草配伍毒效表征及配伍禁忌机制研究(一)芫花与甘草反药组合的毒性评价1芫花、甘草各单味药急性毒性评价观察小鼠单次灌服给予芫花或甘草产生的急性毒性反应,评价其安全性,为比较芫花与甘草配伍前后的毒效实验提供剂量设计依据。结果显示,芫花水提物LDso为52.2g·kg-,,95%的置信限为41.7-66.7g·kg-1,其LDso约为临床等效量的87倍。芫花总提物LDso为18.7g·kg-1,95%的置信限为14.9-23.5g·kg-1。甘草水提物的最大耐受量MTD为96.2g·kg-1,约为临床等效量的48倍。表明芫花水提液与粉末均有毒性,甘草无明显毒性。2芫花与甘草反药组合急性毒性评价观察小鼠灌服给予不同剂量配比的芫花-甘草合煎液或芫花总提物-甘草水提物合并液产生的毒性反应及死亡情况,比较不同配伍组合的毒性差异。结果显示,小鼠单次灌服给予芫花-甘草合煎液后,小鼠出现明显的中毒症状,死亡时间多在给药2h后,死亡率大小顺序为芫花-甘草1：1合煎组>芫花-甘草2：1合煎组>芫花-甘草1：2合煎组>芫花-甘草1：3合煎组>芫花-甘草3：1合煎组,芫花单药和甘草单药对照组无动物死亡。灌服给予芫花总提物-甘草水提物合并液后,小鼠也出现明显的中毒症状,但死亡时间多在给药2h内,死亡率大小顺序为芫花-甘草1：2合并液>芫花-甘草3：1合并液>芫花-甘草1：1合并液>芫花-甘草1：3合并液>芫花单药对照组。表明芫花与甘草合用毒性大于芫花单用。3芫花与甘草反药组合长期毒性评价观察大鼠多次灌服给予不同剂量芫花-甘草合煎液产生的毒性反应,考察不同配伍组合的毒性差异,明确其毒性靶器官。芫花-甘草反药组合大鼠长期毒性主要表现在以下方面：(1)芫花-甘草配比为1：3.3时,在药典临床用量范围内可能产生对消化系统、生殖系统的毒性反应,表现为大便秘结,睾丸附睾系数下降,前列腺病理异常、精子数减少。(2)芫花-甘草配比为1：0.21,且甘草在药典临床用量范围内,芫花在超过药典临床用量高限4倍时,即可见对泌尿系统的毒性,表现为肾系数升高,肾病理异常。(3)芫花-甘量配比为1：53,且芫花在药典临床用量范围内,甘草在超过药典临床用量高限4倍时,即可见对糖脂代谢的影响,血糖、甘油三酯升高,并且肝系数升高,大剂量组大鼠出现消瘦现象。(二)芫花与甘草反药组合的效应评价1芫花与甘草反药组合对正常小鼠利尿及泻下效应的影响基于中医药性与配伍理论,提出甘草的甘缓之性是否平抑了芫花“泻水逐饮”药势的发挥和功效的实现?实验设计比较了药典范围内芫花与甘草合用前后对正常小鼠的利尿及泻下作用。结果显示,醋芫花粉末具有较强的利尿作用且起效较迅速,甘草水煎液可明显抑制芫花的利尿作用。研究结果表明甘草甘缓守中之药性可减缓芫花“泻水逐饮”的取效特点,可能是芫花与甘草配伍禁忌的机制之一。2芫花与甘草反药组合对正常大鼠水盐代谢的影响基于芫花具有“泻水逐饮”之药势,而甘草的糖、盐皮质激素样作用产生“保钠排钾”,形成“水钠潴留”,提出两药合用是否加剧了芫花“泻水”作用导致的水盐代谢平衡失调?实验设计了芫花与甘草合用前后对正常大鼠水盐代谢影响的评价实验。结果显示,甘草可抑制芫花的利尿作用,且合用后尿Na+排泄减少,尿K+排泄增加,血K+含量降低,血中醛固酮、抗利尿激素水平增加。提示甘草具有的糖、盐皮质激素样作用加剧了芫花“泻水逐饮”功效导致的电解质平衡失调,是其相反的可能特征之一3芫花与甘草反药组合对癌性腹水模型小鼠生物效应的影响芫花具有“泻水逐饮”之功效,药力峻猛,适用于水气盛、病情急、肿势甚的实证水肿患者。本实验选用恶性腹水模型,在病理模型下考察芫花与甘草合用前后对癌性腹水小鼠生物效应(腹水量、电解质、醛固酮、抗利尿激素、心肝肾病理组织形态)的影响。结果显示,造模后小鼠腹水量明显增加,血浆Na+、K+、Cl值降低,醛固酮、抗利尿激素水平升高,病理切片可见肝肾损伤。芫花单用腹水量有减少趋势,与甘草合用腹水量无变化；芫花或甘草单用对血浆Na+、K+、Cl浓度和醛固酮、抗利尿激素影响并不显著,但合用使血浆K+升高,醛固酮和抗利尿激素浓度也显著升高。综上所述,癌性腹水小鼠可导致水及电解质的紊乱,芫花与甘草合用后可加重紊乱的趋势,是其相反的可能特征之一。(三)芫花与甘草反药组合的作用机制研究应用代谢组学方法,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术,对芫花单用和芫花-甘草合用的大鼠尿液、血液代谢谱进行分析,筛选毒性作用的潜在生物标志物,阐述芫花致毒和芫花-甘草反药组合致毒／增毒的作用机制,为揭示芫花-甘草配伍禁忌提供依据。结果表明,芫花-甘草合用的毒性反应大于芫花单用。芫花组和芫花-甘草合用组均影响甘油磷脂通路,但芫花单用还主要影响一级胆酸生物合成通路和鞘脂代谢通路；而芫花-甘草合用则主要影响苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路、酪氨酸代谢通路和甘油脂代谢通路。两者对不同代谢通路的调控可能是毒性差异的原因之一。三、芜花与甘草配伍禁忌的物质基础研究(一)芜花化学成分分离与结构鉴定为明确芫花的毒效物质基础,采用硅胶、大孔吸附树脂、Sephadex LH-20柱层析及制备液相等技术对芫花进行了系统的化学成分分离,根据理化性质及波谱数据鉴定其结构。共分离鉴定了44个化合物,包括脂肪类8个、神经酰胺类2个、甾体类4个、萜类10个、黄酮类12个、酚类7个、脱镁叶绿素1个,分别为：正二十四烷(1)、棕榈酸(2)、正二十六烷醇(3)、正二十八烷醇(4)、正二十九烷醇(5)、二十八烷酸十七烷醇酯(6)、棕榈酸-α-单甘油酯(7)、十八烷酸-α-单甘油酯(8),(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-羟基二十二烷酸酰胺]-十八烷-1,3,4-三醇(9)、(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-羟基二十四烷酸酰胺]-十八烷-1,3,4-三醇(10)、木栓酮(11)、δ-香树酯酮(12)、β-谷甾醇(13)、5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-o1(14)、7α-羟基谷甾醇(15)、胡萝卜苷(16)、芫花酯甲(17)、芫花酯乙(18)、芫花酯丙(19)、芫花酯丁(20)、芫花酯戊(21)、genkwanine F (22)、genkwanine N (23)、Wikstroemia factorM1(24)、芫花素(25)、芹菜素(26)、洋芹素-7,4’-二甲醚(27)、金合欢素(28)、3,7-二甲氧基-5,4’-二羟基黄酮(29)、3’-羟基芫花素(30)、椴苷(31)、伞形花内酯(32)、西瑞香素(33)、浙贝素(34)、丁香树脂醇(35)、对羟基苯甲酸(36)、瑞香醇酮(37)、瑞香烯酮(38)、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷(39)、7-甲氧基-木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(40)、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(41)、芫花素-5-O-β-D-茜黄樱草糖苷(42)、芫花素-4’-O-β-D-芦丁糖苷(43)、173-脱镁叶绿素乙酯(44)。化合物3-6、9-12、14-15、24、34、37-38、40、43-44为首次从芫花中分离得到,并首次从该植物中分离得到神经酰胺类、三萜类和叶绿素类化合物。研究结果为芫花与甘草反药组合的毒效评价提供了基础。(二)芫花的毒性物质基础研究为明确芫花的毒性物质基础,对芫花的总脂肪酸、总二萜及总黄酮部位进行急性毒性评价,结果表明总二萜部位为芫花的毒性部位。对毒性部位中的5个代表性二萜芫花酯甲、芫花酯乙、芫花酯丙、芫花酯丁、芫花酯戊进行整体动物和细胞毒性评价,结果显示这5个二萜均具有明显毒性,主要表现为肝脏毒性、胃肠道毒性和引起动物死亡；对大鼠小肠隐窝上皮细胞具有细胞毒性,表现为抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。采用代谢组学技术研究代表性毒性成分芫花酯戊引起大鼠的代谢产物谱改变,结果表明芫花酯戊诱导的肝毒性和肠道毒性主要是由于干扰了生物体的正常氨基酸代谢和脂质代谢,并可能导致肠道菌群失调而加重毒性反应。明确了毒性物质基础及毒性靶器官,揭示了可能的毒性作用机制,为芫花的安全用药及芫花-甘草配伍禁忌的研究提供依据。(三)芫花与甘草合用前后的体外化学成分变化研究芫花中含有的二萜类成分是其主要毒性成分,甘草中的皂苷类成分具有表面活性作用,对脂溶性成分有一定的助溶、增溶作用,两药合煎甘草所含丰富的皂苷类物质,是否促进了芫花中脂溶性的二萜类毒性物质的溶出释放,导致毒性增加?实验采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱与超高效液相色谱串联三重四级杆质谱两种液-质联用技术相结合的手段,探讨芫花／醋芫花与甘草在不同配比组合水煎过程物质相互作用导致化学成分组成的变化及其特点。结果显示,在药典规定的配比范围内随甘草比例升高,芫花不论醋炙与否,其中的二萜类成分相对溶出率均呈上升趋势；而芫花对甘草中的皂苷类成分和黄酮类成分相对溶出率影响较小。本研究结果证实,甘草能促进芫花中二萜类毒性成分溶出率提高,导致两药合煎毒性显著增加,从药物相互作用的角度揭示了芫花与甘草配伍禁忌的可能机制。(四)芫花与甘草合用前后体内过程及相互作用研究1芫花中二萜类成分的药代动力学研究二萜类成分是芫花中的主要毒性成分,通过给予不同剂量的总二萜部位,评价二萜毒性与血药浓度间的关系。本实验建立的超高效液相色谱串联质谱技术可同时测定大鼠血浆中8个二萜类成分：芫花酯甲、芫花酯乙、芫花酯丙、芫花酯丁、芫花酯戌、genkwanine F、 genkwanine N、Wikstroemia factor M1。结果显示,除最低剂量大鼠未出现死亡,其余低、中、高剂量给药后大鼠死亡率均为100%,且总二萜部位的毒性与剂量线性相关,随剂量的升高死亡时间缩短,毒性增加。二萜结构不同,其体内吸收特征差异较大。芫花酯丙、芫花酯戊在二萜部位中含量很低,但血药浓度较高,且大鼠在其血药浓度超过一定值后死亡；与之相反,genkwanine F及Wikstroemia factor M1含量最高,但血药浓度反而最低。推测芫花酯丙、芫花酯戊很可能是芫花的毒性成分。为从体内过程角度研究芫花与甘草配伍禁忌提供了一定的基础。2芫花中黄酮类成分的药代动力学研究黄酮类成分是芫花中的活性成分,且含量较高。本实验通过建立的超高效液相色谱串联质谱技术同时测定大鼠血浆中8个黄酮类成分：芫花素-5-O-p-D-葡萄糖苷,3’-羟基芫花素-5-0-β-D-葡萄糖苷,木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷,芫花素-5-0-β-D-茜黄樱草糖苷,芫花素,芹菜素,3’-羟基芫花素和3,7-二甲氧基-5,4’-二羟基黄酮。黄酮苷类成分在约1h达到最高血药浓度,而黄酮苷元均出现了双峰现象,即在1h达到最高血药浓度后在7h左右又出现一个吸收的高峰,很可能是由于黄酮苷在体内被代谢为苷元后又重新吸收。本实验从药代动力学角度研究了芫花中主要活性成分黄酮的吸收过程,为从体内过程角度研究芫花与甘草配伍禁忌提供了一定的基础。3芫花与甘草反药组合毒性成分体内过程研究选择芫花酯戊作为芫花的代表性毒性成分,采用液质联用技术探讨其与甘草合用前后的体内过程差异,从而分析芫花与甘草反药组合增毒的内在本质。结果显示甘草使芫花酯戊达峰时间提前,降低芫花酯戊达峰浓度,延长平均滞留时间；提示甘草抑制了芫花酯戊的体内吸收,同时抑制其代谢消除过程,长期给药可能会产生蓄积中毒。芫花酯戊单用及与甘草合用后在组织中的分布均是：胃、肠>肝脏>肾脏>心脏>脾>肺>脑,这可能与芫花酯戊的肠道损伤和肝脏损伤有关。芫花酯戊原型主要从粪便排出,合用可抑制其排泄过程,表明甘草可减缓毒性物质的排泄,可能与甘草对芫花的增毒机制有关。四、芫花-甘草反药组合的量-毒-效研究基于多剂量、多指标优化的实验设计,考察芫花与甘草合用前后的毒性作用(对胃肠道、肝肾和生殖器官的毒性)及相关的效应表现(利尿、泻下的效应及对胃肠道运动功能的影响),分析配伍前后安全范围动态变化过程,揭示芫花-甘草反药组合的量-毒-效关系。(一)芫花(水提液)-甘草反药组合的量-毒-效研究芫花在药典范围内单用安全,超出药典3倍即表现出肝肾损伤。芫花在药典范围内与甘草合用无明显毒性；芫花为药典高限3倍,与甘草1：10合用表现为肝毒性；芫花为药典高限9倍,与甘草1：10合用表现为肝毒性,1：3合用表现为肝、肾和生殖器官毒性,1：1合用表现为肝和生殖器官毒性；芫花为药典高限27倍,与甘草1：1合用表现为肝、肾和生殖器官毒性。雄鼠毒性反应较雌鼠明显。合用组芫花剂量低时甘草比例较大才可表现出明显的毒性反应,这正与体外煎煮过程导致的毒性成分溶出变化规律相一致,即芫花与甘草合煎随甘草剂量增加二萜溶出增加,毒性也增加。芫花在药典范围内单用具有利尿作用,泻下作用则不明显,对胃肠运动无显著影响。芫花在药典范围内与甘草合用利尿作用减弱,芫花为药典高限时与甘草1：10、1：1、3：1合用使胃肠运动减弱,所致的滞留时间延长可能会增加机体对药物中某些有毒成分的吸收,从而增毒。(二)芜花(粉末)-甘草反药组合的量-毒-效研究芫花在药典范围内单用无明显毒性反应。芫花与甘草合用,芫花在药典范围内,毒性反应不明显,仅可见个别生化指标及脏器系数降低；超出药典,随芫花剂量增加或甘草比例加大,毒性反应越来越明显,芫花为药典高限2倍,与甘草1：10、1：3、1：1合用可见肝肾毒性；芫花为药典高限4倍,与甘草1：10、1：3、1：1合用可见肝肾毒性。芫花单用,药典范围内及药典高限2倍具有明显的利尿作用,与甘草合用利尿作用则减弱。芫花单用,能增加小肠推进率,对胃内残留率无显著影响；与甘草合用小肠推进率明显减弱,胃内残留率增加。表明药典范围内芫花与甘草合用具有一定的抑制胃肠运动的作用。胃肠运动减弱所致的滞留时间延长也会增加机体对药物中某些有毒成分的吸收,从而增毒。