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第一部分哮喘小鼠肺组织和树突状细胞表面GITRL的表达变化目的:观察哮喘小鼠肺组织和树突状细胞表面GITRL的表达变化,了解GITRL和哮喘发病的相关性。方法:将C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组和屋尘螨（HDM）激发组,用HDM滴鼻致敏和激发建立小鼠哮喘模型。在最后一次激发24小时后,用有创肺功能仪检测各组小鼠的气道高反应性,并收取血清、肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）,ELISA检测血清总Ig E含量,HE染色观察肺部炎症情况,细胞计数仪计数BALF细胞总数,瑞氏染色计数嗜酸性粒细胞比例。Q-PCR、Western blot和免疫组化检测小鼠肺组织中GITRL m RNA和蛋白表达情况。流式细胞术检测小鼠肺组织中树突状细胞表面GITRL的表达。结果:（1）有创肺功能及肺组织HE染色结果显示,HDM激发组小鼠气道高反应性和肺部炎症均较生理盐水组明显增加。ELISA和BALF细胞计数结果显示,HDM激发组血清Ig E含量、BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞的绝对计数均较生理盐水组明显增加。以上说明HDM哮喘模型建立成功;（2）Q-PCR、Western blot和免疫组化结果均显示,HDM激发组小鼠肺组织中GITRL m RNA和蛋白表达水平均较生理盐水组明显升高;（3）流式结果显示,HDM激发组小鼠肺中树突状细胞表面的GITRL分子比例增加。结论:哮喘中GITRL mRNA和蛋白水平较对照组均明显升高,且树突状细胞表面GITRL高表达,提示树突状细胞表面的GITRL可能在哮喘发病中发挥作用。第二部分敲低GITRL对小鼠哮喘表型及CD4+T细胞分化的影响目的:观察GITRL在哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性中的作用,以及对肺部CD4+T细胞分化的影响。方法:构建腺相关病毒AAV-GFP和AAV-shGITRL,经鼻途径给予小鼠。转染2周后,免疫荧光和Western blot观察肺部GITRL敲低效率,流式细胞术检测树突状细胞表面GITRL敲低效果,并用转染后的小鼠建立HDM哮喘模型。最后一次HDM激发24小时后,有创肺功能仪检测小鼠的气道高反应性,ELISA检测血清总Ig E含量,HE染色观察肺部炎症情况并进行炎症评分,细胞计数仪计数BALF细胞总数,瑞氏染色计数嗜酸性粒细胞比例。流式细胞术检测小鼠肺部Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例。结果:（1）免疫荧光及Western blot结果显示,AAV-shGITRL组小鼠肺部GITRL蛋白水平较AAV-GFP组明显降低。流式结果显示,HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠肺部树突状细胞表面GITRL水平较HDM激发的AAV-GFP组明显降低;（2）HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠气道高反应性及肺部炎症均较HDM激发的AAV-GFP组明显减轻,且血清Ig E含量、BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞绝对计数较HDM激发的AAV-GFP组明显减少;（3）流式结果显示,与生理盐水组小鼠相比,HDM激发组小鼠肺中Treg细胞的比例显著降低,Th2和Th17细胞比例增加。然而,与HDM激发的AAV-GFP组小鼠相比,HDM激发的AAV-shGITRL组小鼠肺部Treg细胞的比例增加,Th2和Th17细胞的比例显著减少。各组Th1细胞比例无明显差异。结论:哮喘中小鼠肺部Th1/Th2和Th17/Treg细胞处于失衡状态,敲低肺部和树突状细胞表面的GITRL后,可显著改善哮喘小鼠气道高反应性和肺部炎症,可能与调节CD4+T细胞分化并恢复Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡有关。第三部分BMDCs表面GITRL对CD4+T细胞分化的影响目的:体外观察小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）表面GITRL对CD4+T细胞分化的影响。方法:（1）体外分离培养小鼠BMDCs,用流式细胞术检测细胞的纯度。分别用PBS或HDM刺激BMDCs 24h,Western blot、免疫荧光和流式细胞术检测BMDCs表面GITRL蛋白水平变化;（2）用慢病毒LV-GFP和LV-shGITRL转染BMDCs,用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,并用Western blot、Q-PCR和免疫荧光验证GITRL敲低效果;（3）在PBS或HDM刺激下,将BMDCs与脾细胞进行共培养,流式细胞术检测Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例,并用Q-PCR检测Foxp3、GATA3、RORγt和T-bet m RNA水平;（4）分别用anti-CD3或anti-CD3和GITRL直接刺激脾细胞48h,流式细胞术检测Th1、Th2、Treg和Th17细胞比例,并用Q-PCR检测Foxp3、GATA3、RORγt和T-bet m RNA水平。结果:（1）体外培养的BMDCs纯度大于80%。Western blot、免疫荧光和流式结果显示,HDM刺激后BMDCs表面GITRL蛋白表达较PBS组明显增加;（2）荧光显微镜及流式结果显示,慢病毒转染后GFP阳性细胞的比例约为50%。Western blot、Q-PCR和免疫荧光显示,与LV-GFP组相比,LV-shGITRL组GITRL蛋白和m RNA水平下降约50%;（3）流式结果显示,与PBS处理组相比,HDM处理组中Treg细胞比例显著降低,Th2和Th17细胞的比例明显增加。然而,在HDM刺激下,与LV-GFP组相比,LV-GITRL组Treg细胞比例明显增加,Th2和Th17细胞比例明显下降。各组Th1细胞比例无明显差异。Q-PCR结果显示,与PBS处理组相比,HDM处理组中Foxp3 m RNA显著降低,而GATA3和RORγt m RNA明显增加。敲低GITRL后,Foxp3 m RNA显著增加,GATA3和RORγt m RNA明显降低。各组T-bet m RNA无显著性差异;（4）流式结果显示,与单独用anti-CD3处理的细胞相比,anti-CD3和GITRL联合刺激的细胞中Treg细胞比例显著降低,Th2和Th17细胞的比例升高,Th1细胞比例无显著差异。Q-PCR结果显示,在GITRL刺激下,Foxp3 m RNA表达显著降低,而GATA3和RORγt的m RNA表达增加,T-bet m RNA无明显变化。结论:HDM刺激可增加BMDCs表面GITRL的表达;BMDCs表面的GITRL可能具有调节CD4+T细胞分化的作用,并在一定程度上促成了Th1/Th2和Th17/Treg细胞的失衡;敲低BMDCs表面的GITRL后,可以部分恢复Th1/Th2和Th17/Treg细胞的平衡;体外GITRL刺激可抑制Treg细胞的分化,促进Th2和Th17细胞的分化。