活体光学显微成像技术因其非侵入性实时高分辨多色成像的特点，可以直观呈现免疫细胞在活体中的动态行为，展示各种免疫细胞在何时何地以何种方式介入免疫应答，包括肿瘤免疫。这些动态信息可以证实活体中免疫细胞的功能，揭示活体抗肿瘤免疫应答的机制。肿瘤免疫研究中最常用的经典模型抗原是鸡卵清蛋白（OVA），然而在进行活体可视化研究时，需要肿瘤细胞同时表达荧光蛋白和OVA。但是，荧光蛋白对于小鼠机体是外源表达的蛋白，其免疫源性是个值得关注的问题：荧光蛋白在小鼠体内会对模型抗原 OVA引发的免疫应答产生潜在的干扰。因此，发展一个具有免疫源性的荧光蛋白作为模型抗原，将对活体肿瘤免疫成像研究具有重要意义。　　本课题组前期研究观察到，四聚体深红荧光蛋白（tfRFP）能在小鼠体内诱导有效的免疫应答，并提出将tfRFP作为模型抗原用于肿瘤特异性免疫活体成像研究的设想。本论文研究，比较了tfRFP与经典模型抗原OVA的免疫原性，并基于tfRFP建立了肿瘤特异性免疫应答显微成像研究系统，包括携带背部皮窗的EGFP转基因C57BL/6小鼠、模型抗原tfRFP和稳定表达tfRFP的肿瘤细胞株tfRFP-B16。在该体系中，本研究对tfRFP免疫小鼠tfRFP-B16肿瘤微环境内免疫细胞的响应过程进行了活体动态研究，并对其中免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用进行了分析。主要结果如下：　　(1) tfRFP在C57BL/6小鼠体内诱导的体液免疫比OVA更强，而细胞免疫与OVA相当。本研究发现C57BL/6小鼠初次免疫后的Day7即观察到小鼠血清中抗tfRFP的抗体滴度达2.6×105，并急剧上升至Day17的6.1×106，是相同时间点OVA诱导的抗体滴度的9.0倍；tfRFP在小鼠足垫诱导明显的迟发型超敏反应(DTH)，且与 OVA诱导的免疫应答无显著性差异。这说明tfRFP在小鼠体内同时诱导了显著的体液和细胞免疫应答，可以作为一个荧光模型抗原；　　(2)建立肿瘤特异性免疫应答的活体可视化研究方法。以 tfRFP作为模型抗原，在EGFP转基因C57BL/6小鼠活体水平建立背部皮窗内tfRFP-B16肿瘤模型。长时程活体成像结果显示，tfRFP-B16肿瘤内部形成大量肿瘤新生血管，说明 tfRFP-B16肿瘤在未免疫的小鼠体内具有较强的活力。活体共聚焦成像显示，肿瘤局部有大量EGFP+宿主细胞聚集，并且呈环状包围肿瘤区域，形成相对隔离的肿瘤微环境。本研究用活体双光子显微成像展示了肿瘤微环境内免疫细胞实时动态运动信息，并建立免疫细胞运动轨迹的数据提取和定量分析方法，为后续肿瘤特异性免疫活体显微成像研究打下基础。　　(3)肿瘤微环境内免疫细胞动态反应和肿瘤清除过程的监测。tfRFP免疫小鼠的肿瘤微环境长时程动态成像显示，在肿瘤细胞接种后的Day2，大量EGFP+宿主细胞向肿瘤区域聚集，同时肿瘤细胞也显著被清除，EGFP+宿主细胞在Day7消散。免疫细胞运动参数的定量分析结果显示，在Day2 tfRFP免疫小鼠的肿瘤边缘，免疫细胞以高达9.90±0.16μm/min的平均运动速率以几乎成直线方式向肿瘤区域猛扑，进入肿瘤内部包围tfRFP+微粒在10 min内快速形成细胞团。高分辨活体成像发现，随着免疫应答进行到Day7这种tfRFP+微粒显著增多，并且被免疫细胞吞噬。这些结果表明，tfRFP免疫引发小鼠免疫细胞强烈激活，而对 tfRFP-B16细胞进行免疫清除，从而抑制肿瘤生长。　　(4)肿瘤内部的细胞团为 Ly6G+中性粒细胞而 tfRFP+微粒为抗原抗体复合物。免疫荧光分析发现，在tfRFP免疫小鼠的Day2肿瘤微环境内，聚集成团的主要是中性粒细胞，且其分布与tfRFP+微粒分布相关。tfRFP+微粒不含脂质结构而呈IgG+，是抗原抗体复合物，被肿瘤边缘的F4/80+巨噬细胞大量吞噬。Day7 tfRFP免疫小鼠的肿瘤微环境内浸润CD4+T细胞和CD8+T细胞显著增多。说明tfRFP诱导的肿瘤特异性免疫中，固有免疫和适应性免疫同时参与肿瘤细胞的免疫清除，从而抑制表达tfRFP的肿瘤在小鼠体内的生长。　　综上所述，本课题研究并证实了tfRFP作为荧光蛋白抗原的可行性，建立活体成像动物模型将其用于活体肿瘤免疫成像研究，发现激活的免疫细胞迁移至肿瘤微环境内聚集成团排斥肿瘤，被杀伤的肿瘤细胞释放大量tfRFP+微粒并被巨噬细胞吞噬，引起适应性免疫细胞向肿瘤区域的聚集，维持肿瘤微环境的免疫激活状态，从而抑制肿瘤生长。