第一部分：抗过敏原Der f2单克隆抗体的制备及应用　　背景:　　随着经济及工业化进程的发展，过敏性疾病呈现逐年上升的趋势，已成为全球关注的健康问题。尘螨是引起过敏性鼻炎和过敏性哮喘等呼吸系统过敏性疾病最主要的过敏原之一，而屋尘螨和粉尘螨是存在于我们居住的室内环境中的两种主要螨虫。有效监测居住环境中过敏原的含量及准确定量成分过敏原，将有助于过敏病人更好的规避过敏原，以及指导临床医生更有效的实施脱敏治疗。然而，目前尚缺乏完善的成分过敏原定量工具。目前被发现并克隆、鉴定的尘螨过敏原有30余种，其中组分1和组分2是其主要过敏原，能与约80％以上的过敏病人的血清起反应，其中Der f2（Dermatophagoides farina group2 allergen）是粉尘螨中主要过敏原组分之一。　　目的：　　通过制备Der f2鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体，建立成分过敏原定量检测方法，为环境过敏原的监测以及更有效地实施脱敏治疗提供有利的工具。方法：　　（1）Der f2蛋白与弗氏佐剂一起乳化后免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合。筛选出阳性克隆，进行亚克隆化，得到稳定的抗体分泌株，再接种到小鼠腹腔中诱生腹水。用50%饱和硫酸铵溶液沉淀腹水，Protein A/Protein G亲和层析纯化单克隆抗体，通过免疫印迹（Western Blot, WB）鉴定抗体特异性，间接酶联免疫吸附试验（ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）法测定纯化后抗体的效价。　　（2）用Der f2蛋白加弗氏佐剂免疫新西兰兔，耳缘静脉采血测定血清效价。当血清效价达到要求后，深度麻醉兔子后经颈动脉采血。用间接ELISA测定血清效价，用Western Blot和免疫组织化学法鉴定多抗血清的特异性。　　（3）用纯化的鼠源单克隆抗体作为捕获抗体，用兔源多克隆抗体作为检测抗体，以纯化的Der f2蛋白作为标准品，建立ELISA双抗体夹心法，以定量检测尘样和脱敏制剂中Der f2过敏原组分的含量。　　结果：　　（1）经过三次亚克隆化后，获得4株能稳定分泌针对Der f2蛋白的单克隆抗体的细胞株，其中有一株为IgG1，另一株为IgG2b表型。　　（2）经过三次免疫后，兔血清效价高达到1:106，共获得多抗血清约160 mL。　　（3）利用上述两种抗体，建立了体外过敏原组分含量的检测方法，分别对临床上常用的粉尘螨点刺液、科室自制螨脱敏制剂以及尘样中Der f2过敏原的含量进行了检测。　　结论：　　本研究成功的获得了Der f2鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体，建立了体外组分过敏原检测方法，为临床上特异性免疫治疗及环境过敏原的监测提供有利的工具。　　第二部分：抗过敏原RA17单克隆抗体的制备及应用　　背景：　　随着转基因食品的引入，食物过敏原的定量检测以及转基因食品过敏原性评价受到了社会的广泛关注。大米作为主食谷物历史悠久，全世界大约有一半以上的人口食用大米及其加工产品，其食用范围之广，使得转基因大米中过敏原的定量检测越发的受到重视。建立科学有效的大米过敏原的检测体系，成为现代科学的研究领域的热点话题。大米虽然食用广泛，但其过敏的发生率极低。RA17（Rice allergen17）是大米主要过敏原之一，具有作为转基因食物过敏原性评价基线参照物的潜能。　　目的:　　利用杂交瘤技术制备并纯化 RA17单克隆抗体，建立大米过敏原成分定量检测体系，为市售大米过敏原含量的监测和转基因食物过敏原性评价提供有利的工具。　　方法：　　RA17蛋白与弗氏佐剂一起乳化后免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合。筛选出阳性克隆，进行亚克隆化，得到稳定的抗体分泌株，再接种到小鼠腹腔中诱生腹水。用50%饱和硫酸铵溶液沉淀腹水，再用亲和层析的方法纯化单克隆抗体，进行免疫印迹（Western Blot, WB）鉴定抗体特异性，间接酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）法测定纯化后抗体的效价。利用纯化的抗体作为捕获抗体和检测抗体，RA17蛋白作标准品，建立大米总蛋白中RA17组分定量检测方法。　　结果：　　获得了4株能稳定分泌针对RA17单克隆抗体的细胞株，其分泌的抗体表型包括IgM和IgG1。Western Blot结果表明，此单克隆抗体所识别的靶蛋白分子质量在17 KDa左右。经过亲和层析纯获得纯度较高的单克隆抗体，并利用所获得的单克隆抗体建立了大米中RA17组分定量检测方法。　　结论：　　本研究成功的获得了IgM型和IgG1型RA17鼠源单克隆抗体，并建立了大米中 RA17组分过敏原定量检测方法，为市售大米中过敏原含量的监测和转基因食品过敏原性评价提供了有利的工具。