论文部分内容阅读
C型利钠肽(C-type natriuretic peptide, CNP)是一类广泛表达于哺乳动物各组织中的利钠肽家族成员之一,对哺乳动物减数分裂恢复起重要作用。本研究旨在探讨CNP对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响,并对其作用机制进行初步研究,以期为进一步优化卵母细胞体外成熟体系,提高胚胎体外生产效率奠定基础。首先研究了利钠肽家族主要成员及受体在水牛卵巢的表达情况,利用实时荧光定量PCR检测分析发现：在水牛卵巢中的CNP mRNA表达水平显著高于(P<0.05)A型利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和B型利钠肽(brain natriuretic peptide, BNP),而利钠肽受体II (Natriuretic peptide receptor 2, NPR2)的mRNA表达水平显著高于(P<0.05)利钠肽受体I (Natriuretic peptide receptor 1, NPR1)。通过实时荧光定量PCR结合免疫组织化学等技术进一步检测了CNP和NPR2在水牛卵泡和卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte Complexes, COCs)中的表达情况,结果发现：CNP和NPR2蛋白存在于水牛各级卵泡中,其中CNP主要存在于壁层颗粒细胞,NPR2主要存在于卵丘细胞；CNP的mRNA在颗粒细胞的表达水平显著高于卵丘细胞(P<0.05),而其受体NPR2的]mRNA在卵丘细胞的表达水平显著高于颗粒细胞(P<0.05)；CNP和NPR2在卵母细胞中均无表达。其次探讨了C型利钠肽对水牛卵母细胞减数分裂恢复的影响及其作用机制。水牛COCs先在含不同浓度CNP (OnM,100 nM,200 nM,400 nM)的成熟液中预培养6 h,然后常规成熟培养18 h(即总成熟时间为24 h)。结果发现,200 nM处理组的卵母细胞成熟率(68.36% vs 61.21%)及随后体外受精(In vitro fertilization, IVF)胚胎的分裂率(75.20% vs64.86%)、囊胚率(23.64% vs 16.29%)均显著高于对照组(P<0.05)。选定200 nM为水牛卵母细胞成熟液中CNP适宜添加浓度,探讨CNP处理的适宜时间。结果显示：CNP预培养COCs 6 h或9 h后,卵母细胞的成熟率(68.72%和66.85%)、IVF卵裂率(75.03%和73.96%)和囊胚率(24.38%和23.19%)均显著高于对照组(62.03%,66.83%和18.35%,P<0.05)。然而,200 nM CNP预培养处理裸卵6 h对其成熟率(42.36% vs41.97%)、IVF分裂率(49.73% vs 50.36%)和囊胚率(2.35% vs 2.46%)均没有显著影响(P>0.05)。地衣红染色结果显示：200 nM CNP预培养处理水牛COCs 6 h能显著推迟卵母细胞GVBD的发生时间(P<0.05)。QRT-PCR检测结果发现：水牛COCs经200 nM CNP培养处理6 h后能显著提高其卵丘细胞的Cx37和Cx43以及NPR2的mRNA表达水平(P<0.05),但下调了卵母细胞中PDE3A的mRNA表达(P<0.05)。Elisa检测发现：200 nM CNP培养处理COCs 6 h邑显著提高卵丘细胞、卵母细胞中cGMP浓度(P<0.05),以及卵母细胞中cAMP的浓度(P<0.05)；而NPR2的抑制剂G66976能显著降低CNP提升卵丘细胞中cGMP、卵母细胞中cAMP浓度的幅度(P<0.05)。以上结果表明：(1)CNP及其特异性受体NPR2的mRNA在水牛卵巢中呈现高水平表达,其中CNP主要表达在颗粒细胞,NPR2主要表达在卵丘细胞,但二者在卵母细胞均未见表达；(2)适宜浓度(200nM)的CNP培养处理水牛卵母细胞一定时间(6h)能推迟其减数分裂的恢复,这一作用可能是通过CNP与其受体NPR2相结合,产生cGMP,经缝隙连接途径传递到卵母细胞中,抑制PDE3A的表达,提高卵母细胞中cAMP水平来实现的。