论文部分内容阅读
桃[Prunus persica（L.）Batsch]新梢生长量大,树冠浓密,修剪量大,易造成树体营养浪费,增加生产成本,培育有限矮化、管理省工、适宜密植的生长型是桃遗传改良目标之一。本研究在明确表型响应温度和已有研究基础上（定位区间270 Kb）,以温敏半矮生型桃为载体,开展内源BR响应温度变化、基因精细定位、杂种后代分子鉴定及候选区基因的SNP、InDel和结构变异分析等研究。主要研究结果如下:系统研究了温度对温敏半矮生型和普通生长型桃节间长度与内源油菜素甾醇的影响。采用双温度法（22℃和30℃）进行表型鉴定,‘09-8-25’ב中桃白玉’杂交获得F1代275株实生苗,22℃时表现为节间长度极短,呈极度矮化状态,而30℃时节间伸长,与普通生长型节间无明显差异的植株为温敏半矮生型（Temperature Sensitive Semi-dwarf Peach,PpTssd）;22℃与30℃节间长度均较长且无明显差异的植株为普通生长型（Standard Type,ST）。研究不同温度（22℃、26℃和30℃）对PpTssd型植株茎尖油菜素甾醇水平的影响发现,在各温度处理的植株茎尖中均未检测到油菜素内酯成分;油菜素甾酮含量在3种温度处理条件下差异不明显,30℃时油菜素甾酮的鲜重含量仅为22℃的1.329倍;香蒲甾醇含量在各温度处理间具有显著差异,30℃处理条件下的香蒲甾醇含量是22℃的2.917倍,香蒲甾醇可能与突变性状有关。建立了一种高通量桃DNA提取方法。以‘09-1-112’（Pp Tssd）ב中油桃8号’（ST）杂交F1代500株实生苗为载体,利用1.2 mL八联排管结合改良CTAB法,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA。经检测,提取的DNA浓度范围约25 ng·μL-1200 ng·μL-1,OD260nm/OD280nm约为1.811.98,纯度和完整度较高。利用高分辨率熔解曲线进行验证,PpTssd型和普通生长型呈现明显不同的峰型,分辨率高;聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增稳定,条带清晰,多态性较高;因此,提取的DNA可用于基于SNP/InDel标记的基因分型。利用本研究方法,每人每天可以完成1000个样品的DNA提取,可用于后续目的基因精细定位。基于双亲（‘09-8-25’‘中桃白玉’）重测序对PpTssd基因进行了精细定位。利用上述方法提取‘09-8-25’ב中桃白玉’杂交F1代275株实生苗基因组DNA,基于双亲深度测序,根据亲本的基因型与表型一致,开发SNP/InDel标记共38对,其中16对与目标性状连锁,将目的基因定位至Pp03-SNP3480000与Pp03-SNP3553771两标记之间,物理距离约74 Kb,共包含8个转录本,7个候选基因。基于荧光标记SSR毛细管电泳,对杂交后代6株重组单株进行分子鉴定。经检测,16对荧光SSR引物中,10对在双亲‘09-8-25’、‘中桃白玉’具有多态性差异,多态率为62.5%。毛细管电泳分析结果显示,6个交换单株均为‘09-8-25’ב中桃白玉’杂交F1代,分子鉴定率为100%。基于Sanger测序与二代测序数据,分析候选区间基因的遗传变异。比较AA、aa基因型植株精细定位区间genomic DNA序列,分析SNP、InDel和结构变异,发现在Purpe.3G049700基因5’UTR存在约377 bp缺失,该位点仅存在于PpTssd中,为可能的候选基因。