外泌体（exosomes,Exo）是一类具有生物学活性的,由绝大多数细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）。Exo携带供体细胞的分子生物学信息,参与细胞通讯及多种生理病理过程的调节。在临床上具有药物治疗,疾病诊断,药物递送的应用前景。但是外泌体在临床应用上面临规模化生产困难的问题。另一方面,外泌体的供体细胞类型影响外泌体的生物学功能。不同供体细胞来源的外泌体,在临床上具有不同的应用潜力。在外泌体作为治疗性药物方面,神经干细胞来源的外泌体（neural stem cell-derived exosomes,NSC-Exo）对多种神经系统疾病的治疗具有独特的优势。NSC-Exo携带与神经干细胞（neural stem cells,NSCs）相关的特异性蛋白质,脂质和核酸。另一方面,Exo不具备复制扩增能力,可以规避干细胞治疗过程中的成瘤性风险。但是,NSC-Exo规模化生产主要面临两大挑战,诱导多能干细胞来源的NSCs（induced pluripotent stem cell-derived NSCs,iNSCs）异质性高,以及iNSCs具有容易向神经元或胶质细胞分化的潜力。在外泌体作为药物载体方面,牛奶来源的外泌体（milk-derived exosomes,milk-Exo）具有来源丰富,免疫原性低,耐受胃肠道消化并能够穿过肠道屏障进入血液循环的特点。因此,与细胞上清来源的外泌体相比,milk-Exo在口服递送药物方面更具潜力,特别是治疗需要反复多次给药的慢性疾病,如二型糖尿病（type 2diabetes milletus,T2DM）。由于牛奶中含有大量蛋白质和脂肪,相比于纯化细胞上清来源的外泌体,规模化制备药用级别的牛奶外泌体更加具有挑战性。另一方面,大分子药物如利拉鲁肽（liraglutide,LRT）,由于缺少内在静电力,难以通过电转的方法实现外泌体装载。因此,为了满足临床上对神经系统疾病和T2DM疾病治疗的需求,本课题针对iNSC-Exo及milk-Exo临床应用面临的特殊性及共通性问题,提出可能性解决办法。本课题研究内容分为两大部分:1)以人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）作为NSCs的供体细胞,在hiPSCs中过表达一种对NSCs的增殖和干性起到主要调控作用的孤核受体蛋白—TLX,实现hiPSCsTLX向iNSCsTLX分化。利用TLX作为NSCs干性维持及增殖调控的内在信号调控器,维持iNSCsTLX干性稳定,同时解决iNSCs无法长期扩增问题。此外,建立iNSCTLX-Exo规模化分离纯化工艺,为其在神经系统疾病中的治疗潜力提供新见解。2)将上述iNSCTLX-Exo规模化制备工艺拓展应用于milk-Exo的生产,并制备装载利拉鲁肽的牛奶外泌体（LRT-loaded milk exosomes,LRT-Exo）。针对不同口服给药途径进行药代动力学及药效动力学研究,建立LRT-Exo口服治疗T2DM的方法。第一部分内容研究方法与结果:（1）利用慢病毒感染方式,获得过表达TLX全长蛋白（TLX full-length protein,TLX-FL,1-385 aa）或TLX截短体蛋白（TLX truncated protein,TLX-TP,182-385 aa）的hiPSCs。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）,RAN测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）,流式细胞术（flow cytometry,FCM）,western blot（WB）方法,证明细胞株构建成功。（2）利用FCM,RNA-Seq,qPCR,WB,免疫荧光（immunofluorescence,IF）方法,证明TLX作为内在驱动力,调节SMAD及Wnt信号通路,使hiPSCs向iNSCs自驱动分化,将分化周期从14天或21天缩短到6天,获得Sox2+/Nestin+,Vimentin+/Musashi-1+阳性率均大于90%的iNSCsTLX-FL/TP。（3）利用RNA-Seq,FCM,qPCR,WB,核定鉴定,电生理,IF方法,证明TLX-TP对iNSCs细胞的促进增殖和维持干性的调控能力明显优于TLX-FL,iNSCs TLX-TP细胞能以1:15的扩增速率维持至少45代细胞稳定传代,同时仍具备定向分化为运动神经和多巴胺神经元的潜力。（4）建立基于切向流超滤（tangential flow filtration,TFF）结合多模式色谱法（multi-modal chromatography,MM）和密度梯度离心法（density gradient ultracentrifugation,DGUC）的可放大的外泌体纯化工艺。利用纳米流式（nano flow cytometry,nanoFCM）,WB,透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）,蛋白组定量分析,RNA-seq,以及大鼠原代混合胶质细胞炎症模型及大鼠原代胶质细胞-神经元细胞共培养模型,对iNSCTLX-Exo进行表征评价。结果表明iNSCTLX-Exo纯度接近90%,并且具有显著抑制大鼠原代胶质细胞的炎症反应的能力,及保护大鼠原代神经元的作用。第二部分内容研究方法与结果:（5）利用上述的纯化工艺,对1 M Na3PO4沉淀处理后的牛奶进行外泌体提取。通过nanoFCM,分子排阻-高效液相色谱分析（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC）,WB,TEM方法表征。结果显示,milk-Exo纯度高达97%,并且可实现每10L牛奶中提取（1.37±0.55）×1014颗粒外泌体。（6）分别尝试舌下,灌胃,肠溶胶囊三种不同的给药途径,利用nanoFCM检测啮齿动物血液中被PKH67标记的milk-Exo颗粒浓度,通过与尾静脉给药后最大血药浓度进行归一化,得到各个口服给药途径的相对生物利用度。结果显示,舌下给药途径的相对生物利用度（约为10%）明显高于其他途径给药的相对生物利用度（灌胃组约为0.6%,肠溶胶囊组为0%）。（7）利用超声和共孵育方法装载药物实现milk-Exo对多肽药物的装载。通过酶联免疫吸附反应（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测,载药量为每1×10~8颗粒外泌体装载（6.013±0.163）ng LRT;装载利拉鲁肽的牛奶外泌体（liraglutide-loaded milk exosomes,LRT-Exo）仍能刺激luciferase-GLP-1R-CHO细胞释放luciferase,说明超声不破坏LRT蛋白活性。（8）在db/db糖尿病小鼠模型中对LRT-Exo进行药代动力学和药效动力学分析,舌下给药6×1013particles/kg LRT-Exo,显著降低小鼠随机血糖和空腹血糖,药效与尾静脉注射6×1012particles/kg LRT-Exo组相当。并且小鼠血液中LRT血药浓度能维持至少24h稳定。结论:（1）建立了一套可扩大制备的基于切向流超滤结合多模式色谱法和密度梯度离心法的外泌体纯化工艺。该方法对外泌体的纯化效率高,产率高,样品纯度高,重复性好;并且同时适用于细胞来源与牛奶来源的外泌体的纯化。（2）hiPSCs过表达TLX,可获得低异质性可长期稳定传代的iNSCsTLX,为NSC-Exo规模化制备解决供体细胞问题。（3）解决milk-Exo装载多肽药物问题。并开发milk-Exo舌下给药方法,显著提高LRT-Exo口服生物利用度,降低db/db糖尿病小鼠血糖,加速milk-Exo口服递送多肽药物临床应用的转化。