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第一部分靶向RhoAmRNA的shRNA真核表达质粒的构建及扩增目的利用真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo,构建靶向RhoAmRNA的shRNA表达质粒(pGPU6/RhoA-shRNA),并进行大量扩增,为后续的DMED基因沉默治疗研究提供工具。方法根据大鼠RhoA基因序列,设计一条靶向RhoAmRNA的特异性shRNA序列,人工合成此特异性序列表达模板的DNA正反义链,通过退火反应配对正反义链,再通过酶切、连接反应,将目的片段插入真核表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo,转化E. Coli、DH5α感受态细菌,通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆,再经酶切和测序鉴定所得克隆,确证pGPU6/RhoA-shRNA构建成功后,再用QIAGEN Plasmid Midi Kit大量扩增、纯化质粒备用。结果所构建的重组质粒pGPU6/RhoA-shRNA经BamHI和EcoRI酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳后,所得条带符合所设计的质粒大小。选酶切鉴定符合要求的克隆进行测序,测序结果同所设计的pGPU6/RhoA-shRNA序列完全一致。结论通过分子克隆技术成功构建重组真核表达质粒pGPU6/RhoA-shRNA。第二部分糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型的建立目的建立DM大鼠模型,并测定其阴茎海绵体内压(intracavernous pressures, ICP),确定其ICP较同龄正常雄性大鼠显著下降,为进一步行DMED的靶向沉默RhoA基因治疗提供理想的动物模型。方法28只10周龄SD雄性大鼠,体重220-250g,随机分成对照组(n=12)和实验组(n=16)。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液60mg/kg,对照组腹腔注射相应剂量的STZ溶剂(0.1MpH4.5枸椽酸钠溶液)。注射后4d,于尾静脉采血测血糖,后每2wk测血糖1次。STZ注射后10wk,测定造模成功的糖尿病大鼠和所有对照组大鼠阴茎的基础阴茎内压(ICP)和神经刺激诱导ICP,再处死大鼠测定阴茎组织中RhoAmRNA、RhoA蛋白表达量。结果(1)一般情竘STZ注射后第7wk、8wk各有1只大鼠死亡。第8wk有1只大鼠血糖未达糖尿病标准,糖尿病表现也不明显,判为STZ抵抗。实验组16只大鼠造模成功13只(设为组),成功率为81.3%。(2)血糖，体重DM组STZ注聚后4d、2w、4w、6w、8w、10w的血糖水平均显著高于对照组(P<0.001)；STZ注射前DM组和对照组的体重无显著性差异(P>0.05),而注射后10wk DM组的体重显著低于对照组(P<0.001),平均体重较对照组低28.3%。(3)RhoAmRNA、RhoA蛋白的表达STZ注射后10wk,DM组RhoAmRNA和RhoA蛋白表达的相对量均显著高于对照组(P<0.001,P<0.002)。(4)两组大鼠间ICP比较STZ注射后10wk,DM组的基础ICP和神经刺激诱导ICP分别为10.6±3.6cmH2O和46.5±16.3cmH2O,分别显著低于对照组的48.6±13.5cmH2O和140.1±33.9cmH2O(均P<0.001),DM组的基础ICP和神经刺激诱导ICP较对照组分别低78.2%和66.8%。结论以STZ腹腔注射制作DMED大鼠动物模型,成功率高,稳定性好；以ICP作为评定DMED大鼠的阴茎勃起功能,关联性好,敏感性高。第三部分pGPU6/RhoA-shRNA靶向沉默RhoA基因及其对糖尿病大鼠勃起功能的影响目的通过重组真核表达质粒pGPU6/RhoA-shRNA,将SiRNA导入DM大鼠阴茎海绵体组织以靶向沉默RhoA基因,并研究其对DMED大鼠勃起功能的作用。方法SD雄性DMED大鼠102只,随机分成三组：pGPU6/RhoA-shRNA处理组(A组)、pGPU6/NC空质粒对照组(B组)、转染试剂Lipofectamine2000+PBS对照组(C组)。A组每只大鼠阴茎海绵体注射含pGPU6/RhoA-shRNA200μg的Lipofectamine2000+PBS液,B、C组分别注射相当量的pGPU6/NC空质粒和Lipofectamine2000+PBS液。分别于注射后1w、2w、3w和4w,每组随机选取8-9只大鼠在麻醉下进行基础和神经刺激诱导ICP测定,然后处死大鼠,从根部切除完整的阴茎组织,分别用RT-PCR和Western Blot法半定量测定阴茎组织中RhoAmRNA和RhoA蛋白含量。结果(1)RhoAmRNA表达水平注射后1w、2w、3w、4w, A组RhoAmRNA含量均显著低于B、C组(均P<0.001),而B、C组间均无显著性差异(P>0.05)；A、B、C组内1w、2w、3w、4w RhoAmRNA的含量间均无显著性差异(P>0.05)。(2)RhoA蛋白表达水平注射后1w、2w、3w、4w, A组RhoA蛋白表达相对量均显著低于B、C组(均P<0.001),而B、C组间均无显著性差异(P>0.05)；A、B、C组内1w、2w、3w、4w RhoA蛋白含量间均无显著性差异(P>0.05)。(3)ICP水平①基础ICP：注射后1w、2w、3w、4w, A、B、C组间比较均无显著性差异(P>0.05)；三组内不同时间点之间比较,注射后1w、2w、3w、4w的基础ICP间均无显著性差异(P>0.05)；②神经刺激诱导ICP注射后1w、2w、3w、4w,A组神经刺激诱导ICP均显著高于B、C组(均P<0.001),而B、C组间均无显著性差异(P>0.05)；三组内不同时间点之间比较,注射后1w、2w、3w,4w的神经刺激诱导ICP间无显著性差异(P>0.05)。结论成功将重组质粒pGPU6/RhoA-shRNA转染DMED大鼠阴茎海绵体,并持续稳定表达至少4w,同时使DMED大鼠的勃起功能得到明显改善。