棉花是世界上最重要的天然纤维作物之一,我国是世界上主要的棉花生产国和消费国,棉花在我国国民经济中占有重要地位。棉花纤维是棉花的主要产品,其生长发育过程决定了成熟纤维的产量和品质。同时,棉花纤维作为极度伸长的植物细胞,是研究植物细胞分化、生长和次生壁增厚的理想材料,因此研究棉花纤维具有重要的理论意义和应用价值。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期：纤维细胞起始期,纤维细胞伸长期,次生壁增厚期和脱水成熟期。近年来,许多研究者致力于探究纤维发育的分子机制,但迄今为止,调控纤维发育的关键基因和调控机理还不甚清楚。植物固醇是植物中一大类具有甾环结构的物质,其中含量较高的有谷固醇、菜油固醇和豆甾醇等。植物固醇既是植物激素油菜素类固醇(BRs)的合成前体,也是生物膜的组成成分之一,对生物膜的流动性和透性有调控作用,因此在植物生长发育中具有重要作用。纤维细胞生长过程中生物膜面积的扩大十分明显,是变化剧烈的细胞器之一。作为膜组成成分和膜性质调控因子的植物固醇可能在纤维发育中具有重要作用。C-4去甲基反应是固醇合成中的一个关键反应,由C-4去甲基复合酶体完成。为了探索植物固醇在纤维发育中的作用及其机制,本论文从棉花纤维中克隆了C-4去甲基复合酶体中的3p-羟基类固醇脱氢酶基因(Gh3β-HSD)。通过序列和表达特征分析、在烟草和棉花中超量表达以及在棉花中抑制该基因的表达,分析了该基因在棉花生长发育中的功能,特别是对纤维发育的影响。获得了如下的结果：1.克隆了棉花中3β-HSD的同源基因Gh3β-HSD利用拟南芥3p-羟基类固醇脱氢酶(At3β(3-HSD)蛋白质序列搜索棉花EST数据库,并对高同源性的EST序列进行整合分析进而设计特异引物从陆地棉徐州142野生型12DPA纤维的cDNA扩增出一段特异序列。序列分析结果表明该序列长2061bp,包含一个长1683bp的完整ORF,由此推导的氨基酸序列长560个氨基酸残基,蛋白质分子量61.6KD,等电点为9.256。与cDNA序列对应的基因组序列长5039bp,由12个外显子和11个内含子组成。推导的氨基酸序列是一个膜结合蛋白,具有三个跨膜结构域。与拟南芥、烟草、杨树和水稻等物种的3β-羟基类固醇脱氢酶具有较高的同源性,其中与葡萄3β-HSD的相同性为75%,相似性为86%;与拟南芥3β-HSD的相同性为70%,相似性为84%。系统进化分析显示棉花3β-HSD与葡萄、杨树、蓖麻的3β-HSD的亲缘关系较近。这些结果证明克隆序列是3p-羟基类固醇脱氢酶基因的同源基因,命名为Gh3β-HSD。2.分析了Gh3β-HSD基因的表达特征基因的表达模式是分析基因功能的重要依据。为了初步分析Gh3β-HSD基因在棉花生长发育中的功能,通过定时定量RT-PCR检测了该基因的表达特征。该基因在纤维细胞中的表达水平最高,其次在幼嫩茎、叶和胚珠中具有较高的表达水平,在根、子叶和下胚轴中的表达水平较低,在雄蕊中几乎不表达。说明Gh3β-HSD基因的表达具有组织器官特异性,在纤维、胚珠、幼茎和叶中优势表达。进一步分析表明,该基因在6DPA至20DPA纤维中的表达水平高于相同发育时期的胚珠中以及0DPA和2DPA的胚珠(含纤维)中的表达水平,说明该基因在纤维中优势表达,与纤维发育有密切关系。3.通过转基因烟草分析了Gh3β-HSD基因启动子的功能为了更加准确地了解Gh3β-HSD基因的时空表达特性和调控因素,本文克隆了该基因1987bp的5’-上游调控序列。序列分析表明该序列中不仅包含许多光反应元件和增强子序列,而且还包含厌氧反应元件、真菌反应元件、胚乳表达序列、防御和胁迫反应元件、BRs响应元件、水杨酸和乙烯反应元件等。说明Gh3β-HSD基因的表达受多种因素影响。进而开展了启动子删除实验,以pBI121载体中的GUS基因为报告基因,检测了不同长度的启动子序列在转基因烟草中的表达特性。结果显示904bp的启动子序列在转基因烟草中没有表达活性,1598bp的启动子序列在茎表皮毛和维管组织中具有较高的表达活性,而且在幼茎中的表达水平相对较高。该序列在叶表皮毛和叶肉中有一定量的表达,在根中的表达主要集中在根尖、根毛区和侧根着生部位。同时其在叶和茎中的表达受水杨酸的诱导。4.通过转基因烟草分析了Gh3β-HSD基因的功能为了尽快了解Gh3β-HSD基因的功能,首先在烟草中表达Gh3β-HSD基因。结果显示在烟草中表达Gh3β-HSD基因增加了种子千粒重,并能促进种子萌发。T1代转基因烟草的株高和主根长度与对照相比有所增加,不过最明显的是侧根数量的增加。同时在烟草中表达该基因在一定程度上能够提高烟草的耐盐性。这些结果表明克隆的Gh3β-HSD基因是一个有功能的序列,超量表达Gh3β-HSD影响了烟草的生长发育。5. Gh3β-HSD表达水平的变化影响了棉花植株的发育通过棉花的遗传转化和转基因植株鉴定以及表达分析,获得了超量表达和反义抑制GH3β-HSD基因的转基因棉花。To代性状变异观测结果显示超量表达Gh3β-HSD转基因棉花叶色较墨绿,果柄变长,棉铃变小,种子体积变大,数量变少,同时超量表达Gh3β-HSD降低了花粉育性。部分T1代超量表达Gh3β-HSD转基因棉花侧枝较短,节间缩短。相反抑制Gh3β-HSD的表达,转基因棉花植株极度矮小、叶片变小、节间变短、侧枝变短。茎上表皮毛数量和野生型棉花相比明显减少。大多数转基因植株不能正常开花,有少数植株能正常地开花,但不能正常结桃。这些结果表明无论是超量表达Gh3β-HSD基因还是反义抑制Gh3β-HSD的表达都影响棉花植株的生长,Gh3β-HSD在棉花植株的生长发育过程中有重要作用。6. Gh3β-HSD表达水平的变化对棉花纤维生长发育的影响在棉花中增加Gh3β-HSD基因的表达抑制纤维的起始和伸长。超量表达Gh3β-HSD T。代转基因成熟纤维长度与野生型没有明显区别,但T1代转基因棉花纤维长度与对照相比明显变短。由于抑制Gh3β-HSD基因的表达不能得到成熟纤维,因此利用棉花胚珠离体培养体系检测了纤维生长的变化,结果显示抑制该基因的表达也抑制了纤维的生长。同样使用3β-羟基类固醇脱氢酶的特异抑制剂曲洛斯坦处理野生型胚珠也得到相似的结果。这些结果说明Gh3β-HSD基因在棉花纤维生长发育中有重要作用。