昆虫先天免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,细胞免疫主要是通过昆虫血液中的浆细胞对入侵的微生物进行吞噬,而昆虫的体液免疫比较复杂,涉及到昆虫体内许多蛋白质间的相互作用,其中丝氨酸蛋白酶及其同源物在食物消化、胚胎发育和先天免疫等方面具有重要作用。根据研究报道,家蚕基因组中含有143个丝氨酸蛋白酶编码基因,分别编码51个丝氨酸蛋白酶和92个丝氨酸蛋白酶同源物,然而到目前为止,对于这些这些蛋白酶的具体功能和作用机制还不甚清楚。本课题以家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142为研究对象,对其进行序列分析和表达特征分析;利用原核表达系统对其进行表达并纯化到其可溶性靶蛋白,体外对其丝氨酸蛋白酶活性进行分析;利用纯化的BmSP142免疫小鼠获得其多克隆抗体;通过qPCR和制备的多抗分别对BmSP142进行转录时相和表达时相分析;最后对家蚕体内和细胞水平上阐明BmSP142蛋白在抗病毒侵染和增殖中的具体作用。进而为深入了解家蚕先天免疫系统奠定基础。本研究论文主要结果如下:(11)生物信息学分析发现,家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142中1-22位氨基酸为信号肽序列,能够指导蛋白向胞外分泌;同时,该蛋白具有类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶结构域(Trypsin-like serine protease),该结构域中具有丝氨酸蛋白酶特有的三联体催化中心H(His)-Asp(D)-Ser(S)。组织分布结果表明:BmSP142特异性地表达于家蚕中肠中,且多表达在家蚕中肠中部。这些序列分析结果为后续相关功能研究提供了方向和基础。(12)构建融合有GST标签的BmSP142重组表达质粒,对其进行原核诱导表达,获得可溶性的重组蛋白;对纯化的可溶性重组蛋白进行质谱鉴定及后续的酶活性分析;同时用重组表达产物免疫小鼠,制备其多克隆抗体,为该蛋白后续相关研究提供材料。(13)转录时相分析结果显示:与健康家蚕中肠组织中BmSP142基因的表达量相比,BmBDV病毒感染的家蚕中肠中该基因表达量呈明显上调趋势,而BmNPV病毒感染后的家蚕中肠中该基因表达量呈下调趋势;而抗性品系798家蚕口服BmBDV病毒24 h后、以及抗性品系NB家蚕口服BmNPV病毒24小时后,qPCR结果表明:病毒感染24 h后,抗性品系家蚕中肠组织中的BmSP142基因表达量急剧上升,病毒感染的易感品性家蚕306和华八三五中BmSP142表达水平很低。BmSP142基因在病毒感染后RNA水平上调暗示了,家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142在抵抗病毒侵染和增殖中发挥着一定的作用。(14)将纯化获得的、具有生物学活性的家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142分别与BmBDV病毒粒子以及BmNPV病毒粒子共同孵育后,用孵育混合物感染家蚕,感染后提取家蚕中肠组织中总DNA,通过qPCR检测病毒DNA的复制情况。同时对未经BmSP142处理的病毒粒子感染后的家蚕中病毒拷贝进行检测,结果表明:BmSP142共孵育的病毒粒子感染家蚕后,其病毒拷贝数明显低于未处理组感染的家蚕中肠中的病毒拷贝。随后,将携带荧光标签的BmNPV病毒粒子与BmSP142共孵育后,感染家蚕BmN细胞,荧光显微镜观察结果显示:随着与病毒孵育的家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142量的增加,其所感染的细胞中荧光数量越来越少。另外,将瞬时表达BmSP142的重组质粒转染BmN细胞,将携带绿色荧光标记的重组BmNPV病毒对转染48 h后的细胞进行感染,对感染后的细胞进行连续时间点荧光显微观察,其荧光数量明显少于未转染BmSP142瞬时表达质粒的细胞中的荧光数量,该结果表明:BmSP142能够有效地抑制病毒的增殖。上述研究结果表明:家蚕BmSP142蛋白是一种丝氨酸蛋白酶,能够抑制病毒的感染和增殖,与家蚕抗病毒入侵和增殖直接相关,为深入研究家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP142在先天免疫中的作用及分子机制奠定基础。