胚胎干细胞（ESC）是一种多能性细胞，具有自我更新无限增殖的能力，具有向体内各胚层细胞分化的能力。嵌合实验表明，胚胎干细胞具有生殖系嵌合能力，将性状遗传到下一代，这也是胚胎干细胞独有的特性。应用这一特性，可嵌合生成基因修饰动物。基因修饰动物在基础医学的研究，药物实验的研究，疾病的研究有广泛的应用，因此胚胎干细胞在医学研究和动物性状改变研究有很重要的意义。目前，小鼠、大鼠和人胚胎干细胞技术已经成熟，而大动物还没有成熟的胚胎干细胞技术平台。猪是人类疾病的良好动物模型，也是异种器官移植的理想材料。而猪ESC作为研究性状改良、胚胎发育和医学模型的理想工具。因此，探索猪ESC细胞的适宜培养条件非常必要。本实验首先观察猪早期体外胚胎的形态和测量直径；通过降低孔板液体量提高囊胚贴壁率；比较双因子培养液和四因子培养液对猪ESC分离的影响；以得到的实验数据对分离真正的猪胚胎干细胞进行探讨。为了能直观的观察分离得到的猪ESC克隆的多能性基因表达和优化培养体系，我们利用TALEN介导同源重组，将带有2A肽序列的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因定点插入Oct-4基因第5外显子的终止密码子处，利用内源性Oct4启动子驱动Oct4和eGFP表达，通过克隆技术得到精确模拟内源性Oct4表达的囊胚。已通过筛选获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。经CRE酶处理后，该细胞制备的克隆囊胚在分离猪ESC过程中可借助OCT4-eGFP荧光标记来确定分离得到的pES克隆是否表达Oct4基因，有利于pES多能性鉴定和培养体系的优化。主要的实验方法和实验结果如下：第一部分我们对猪早期体外胚胎进行形态观察和直径测量。统计数据表明，猪体外早期胚胎的胚龄与直径成正比。同一胎龄的核移植胚胎、孤雌胚胎之间发育不同步，用胎龄对猪早期体外胚胎进行划分是不科学的。孤雌胚胎的贴壁率要高于核移植胚胎（37.1%，22.8%），降低孔板液体量可以有效的提高体外胚胎的贴壁效率（22.8%，59%）（P<0.05）。随后用猪体外胚胎进行胚胎干细胞的分离。实验设计两组培养液进行比较：用双因子培养液我们得到了上皮样集落，并传三个代次，但RT-PCR鉴定结果该细胞克隆表达Cdx2基因，并不表达Oct4基因。用四因子培养液分离得到2个小集落，集落传代后不增殖。第二部分通过剪取猪耳，建立猪耳成纤维细胞系WPF17-1和WPF17-2。耳成纤维细胞药物压力筛选结果显示300μg/mL浓度为筛选的适宜浓度。将构建好的Donor质粒线性化后与TALEN mRNA共同转染WPF17-1和WPF17-2两耳成纤维细胞系，通过新霉素和丙氧鸟苷的正负药物筛选，经过16天的连续筛选，获得细胞克隆13个，经鉴定获得4个阳性克隆。已获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。