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研究背景:随着现代社会环境、社会人群心理状态及生活习惯的改变,甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)的发病率呈现一种逐渐上升趋势。在美国每年大约有37000例新发病例,每10万人口年平均约有16例女性和2.9例男性发病的患者。它是一种与内分泌系统及免疫系统相关疾病,确切的发病机制不清楚,最近研究表明Ig G4可能与它也存在一定相关性。该病多双眼发病,以眼球突出、眼睑肿胀退缩、上睑迟落、结膜充血水肿、眼外肌麻痹等为主要临床表现,严重时可由于眶内肌肉组织压迫视神经或眼球过于突出而形成暴露性角膜炎导致失明。从病理学来看,它主要是由于眶内脂肪组织增多和眼外肌肥厚纤维化及炎性病变为特点。其中眶内脂肪组织病变在发病中占据了很重要的作用。作为自身免疫性疾病促甲状腺素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)多年来被认为是TAO自身免疫主要抗原。但对于自身抗原究竟是一种还是多种参与一直没有定论。在早期的研究中就曾经发现TSHR抗体免疫沉淀复合物可以有效地作用在胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor receptor-1,IGF-1R)上,并且认为它可能参与了疾病发展过程。近几年有学者通过实验提出了TSHR/IGF-1R的复合共同体学说,他们通过免疫共沉淀法发现IGF-1Rβ亚单位与TSHR共同存在于Graves’眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)患者眼眶成纤维细胞和甲状腺上皮细胞中,加入IGF-1R的拮抗剂后可以明显抑制GD-Ig G的信号传导作用。后期的动物模型实验也进一步证实了IGF-1R在TAO的发病中起了很关键的作用。而作为IGF-1R的配体胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是组织生长代谢的重要因子,它可以促进成纤维组织透明质酸钠及粘多糖的合成,而GO眼眶组织病理改变与粘多糖沉积有直接的关系。虽然IGF-1主要来源于肝脏组织细胞但也在其他组织中发现分泌现象,敲除基因小鼠的实验里发现脂肪组织中IGF-1升高明显,推测脂肪组织也可能分泌IGF-1。在甲状腺相关眼病的临床研究中也发现疾病组中血清IGF-1较对照组有明显升高。另外Delu在实验中发现甲状腺相关性眼病患者中成纤维细胞存在IGF-1自分泌的现象。以上都表明IGF-1R及配体IGF-1可能在TAO发病中发挥一定作用。IGF-1自发现以来就不断被证实并认为它和与机体内许多组织的增殖生长及分泌功能有密切联系。作为与胰岛素家族类似的一种蛋白,IGF-1有着与胰岛素很多相似的作用。已经有研究表明胰岛素可以促进脂肪细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),PAI-1在体内的主要作用是调节组织型纤溶酶原激活(tissue-type plasminogen activator,t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活(urokinase-type plasminogen activator,u-PA)两者之间的代谢平衡,通过影响细胞外基质中胶原蛋白代谢平衡而改变纤维化过程,这在肺、肝、皮肤等组织纤维化相关研究中都被证实。在对TAO患者泪液分析研究中发现GO组患者泪液中的PAI-1蛋白比Graves’病(Graves’disease,GD)组有明显的提高,而且与病情的活动程度有一定相关性。虽然具体相关机制还不清楚但这给了我们一些提示:GO患者眼眶组织中有可能存在PAI-1异常分泌的现象。TAO的发病除了与免疫性自身抗原有着明确的关系外,体内其他一些生理机制的紊乱和异常也是导致其发生的重要原因。作为体内一种重要内在平衡机制的自噬是一种基因程序性的调控行为,在组织生长代谢及自我保护方面起了重要作用。在一般生理情况下它通过降解或重新利用细胞器及相关蛋白来维持细胞自身的代谢平衡;在病理情况下则为细胞器的自身修复和再生提供必需的原料。自噬过程与人类很多疾病都关系紧密,其中也包括我们常见的一些自身免疫性疾病。比如在脱髓鞘和多发性硬化疾病相关研究过程中发现自噬蛋白Atg5在组织中出现了异常高表达现象。此外实验发现脂肪细胞分化的过程也有自噬活动的参与,在小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化时通过电镜可以观察到自噬小体含量的增加。IGF-1R作为细胞重要的受体也参与了体内一些组织自噬过程。尽管如此,甲状腺相关眼病的发病是否与自噬活动有关还不清楚。本研究是建立在上述研究背景条件下,对眼眶脂肪组织及细胞进行相关基础实验研究。第一部分首先主要通过对眼眶脂肪组织进行IGF-1R蛋白及m RNA检测,希望了解TAO患者与对照组之间是否存在差异及蛋白分布情况;其次通过对原代眼眶前脂肪细胞进行提取、培养、鉴定后,探讨IGF-1对两组细胞增殖能力的影响;最后观察分化过程中IGF-1R变化和IGF-1自分泌情况及脂化作用;第二部分主要是了解TAO患者眼眶脂肪组织中PAI-1是否存在异常表达及分布情况,在前脂肪细胞分化过程中探讨IGF-1对PAI-1的合成影响及相关机制;第三部分是通过对自噬标志性LC3蛋白进行检测对比TAO组和对照组患者眼眶脂肪组织中自噬水平变化情况,并探讨眼眶前脂肪细胞分化过程是否存在自噬过程及影响其水平的相关机制。研究方法:1.应用Western Blot和RT-PCR方法对TAO组和对照组的眼眶脂肪组织IGF-1R、PAI-1、LC3进行检测;2.应用免疫组化技术对TAO组和对照组的眼眶脂肪组织冰冻切片行IGF-1R、PAI-1定位及半定量检测;3.提取眼眶脂肪组织的原代前脂肪细胞,对其进行培养、传代,利用Pref-1特异性抗体通过流式细胞仪对前脂肪细胞细胞进行鉴定及筛选;4.使用CCK8技术观察不同浓度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)对眼眶前脂肪细胞增殖再生能力的影响;5.利用Western Blot技术观察眼眶前脂肪细胞不同分化时间阶段LC3、Atg5及分化前后IGF-1R蛋白表达情况;通过RT-PCR检测分化后PAI-1、PPARγ、IGF-1的变化情况;6.不同浓度IGF-1(0n M,1n M,5n M,10n M,20n M)作用于分化的TAO前脂肪细胞组了解LC3、Atg5蛋白表达情况;通过RT-PCR检测分化后PAI-1、PPARγ的变化情况;并利用油红O染色检测脂肪化程度;7.观察PI3k抑制剂LY294002、AKT抑制剂MK2206对IGF-1作用下TAO前脂肪细胞分化时的作用,通过Western Blot检测LC3、Atg5蛋白表达的变化情况,同时了解分化后PAI-1、PPARγ的改变情况。研究结果:1.Western Blot和免疫组化显示TAO脂肪组织中IGF-1R、PAI-1蛋白表达量高于对照组;而LC3蛋白表达量低于对照组;2.TAO及对照组眼眶前脂肪维细胞体外分化无明显差异;3.IGF-1可以促进眼眶前脂肪细胞增殖,在TAO组更为明显;4.TAO组前脂肪细胞IGF-1R蛋白在分化前后表达量高于对照组;5.TAO组前脂肪细胞分化过程中早期的LC3、Atg5表达与分化后PAI-1、PPARγm RNA表达与对照组无明显差别;而IGF-1 m RNA表达量在TAO组要高于对照组;6.IGF-1抑制前脂肪细胞分化过程中LC3、Atg5蛋白表达,促进PAI-1m RNA、PPARγm RNA的表达;7.IGF-1R通过PI3K/AKT信号传导通路来调控前脂肪细胞分化中PAI-1m RNA、PPARγm RNA和LC3、Atg5蛋白的表达。结论:1.TAO眼眶脂肪组织及脂肪细胞高表达IGF-1R,IGF-1可以促进眼眶前脂肪细胞增殖和分化;2.TAO眼眶前脂肪细胞分化过程中IGF-1自分泌明显增强;3.自噬在TAO眼眶脂肪组织中水平较低,前脂肪细胞体外分化早期阶段可见较明显自噬;4.TAO眼眶脂肪组织表达较多PAI-1,IGF-1可以促进眼眶前脂肪细胞PAI-1的表达;5.IGF-1R可以通过PI3K/AKT信号通路调控前脂肪细胞分化和LC3、Atg5、PAI-1的表达。