目的近年来,随着糖尿病发病率的不断提高,糖尿病相关的溃疡以及创面越来越成为一个世界性的问题。糖尿病溃疡是一种慢性的并且难以愈合的创面。其原因主要有两个方面,第一是创面局部微循环的紊乱,第二是内源性的生长因子水平显著降低。在所有促进血管化的生长因子中,VEGF扮演了一个十分重要的角色。VEGF能够增加创面局部的毛细血管密度,从而提高了创面局部的血流灌注及新陈代谢,并最终促进创面的愈合。VEGF对于创面血运的重建以及肉芽的形成十分重要。在糖尿病溃疡创面中,局部相对较低的VEGF浓度是造成其难以愈合的主要因素之一。在体外研究中已经证实VEGF能够有效地促进血管内皮细胞的增殖及迁移,并且可以触发一系列的反应,从而诱导新生血管的形成。有报道指出,VEGF在糖尿病溃疡创面中能够促进血管化程度以及提高局部血供,并且具有剂量依赖效应。尽管众多报道均指出VEGF对糖尿病溃疡的愈合有十分重要的作用,但是如何在局部安全有效地使用仍然是一个未解决的问题。局部低剂量的VEGF难以有效地发挥其促血管化的作用,但是过高剂量的VEGF又会导致血管瘤形成的风险,如果VEGF扩散入循环血中,会导致一系列的并发症。并且,有报道指出,在糖尿病大鼠的局部创面中,血管化程度的降低以及I型胶原含量的降低都是十分明显的。以上两点原因导致了溃疡愈合时间的延长以及愈合质量的降低。因此,我们将外源性VEGF采用基因重组的方法绑定在I型胶原上,制成蛋白溶液和胶原膜片,并局部应用于大鼠糖尿病溃疡创面的治疗,研究其在促进糖尿病溃疡愈合中的机制,探讨如何更好、更有效、更安全地利用外源性VEGF。方法材料：将外源性VEGF经过组氨酸标记后通过基因重组的方法绑定于I型胶原并制成蛋白溶液和胶原膜片备用。实验方法第一部分1.72只SD大鼠随机分为A、B、C三组,制备大鼠糖尿病溃疡模型,所有实验动物术前均接受血糖及体重的测量；2.A组：对照组,SD大鼠溃疡创面局部喷洒PBS溶液；B组：NAT-VEGF组,SD大鼠溃疡创面局部喷洒NAT-VEGF蛋白溶液；C组：CBD-VEGF组,SD大鼠溃疡创面局部喷洒CBD-VEGF蛋白溶液；3.每次给药后5分钟用无菌纱布绷带包扎,给药时间为21天；4.分别于术后第3d、7d、14d、21d处死动物并取样；5.各组于每个时间点拍照,计算和比较创面愈合率；6.各组于每个时间点取创缘肉芽组织行组织学观察,包括HE染色,免疫组化染色,比较各组创面肉芽血管化程度及外源性VEGF的局部绑定能力；7.各组于术后第7d给药后3小时和6小时两个时间点,用Elisa法检测外周血VEGF的含量；第二部分1.96只SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,构建大鼠糖尿病溃疡模型,所有实验动物术前均接受血糖及体重的测量；2.所用胶原膜片行扫描电镜检查,观察其三维结构及孔隙大小；3.A组：空白对照组,SD大鼠溃疡创面局部无胶原膜片覆盖,术后无菌纱布绷带包扎；B组：PBS组,SD大鼠溃疡创面局部空白胶原膜片(胶原膜片负载PBS)覆盖,缝合固定后无菌纱布绷带包扎；C组：NAT-VEGF组,SD大鼠溃疡创面局部NAT-VEGF胶原膜片(胶原膜片负载NAT-VEGF)覆盖,缝合固定后无菌纱布绷带包扎；D组：CBD-VEGF组,SD大鼠溃疡创面局部CBD-VEGF胶原膜片(胶原膜片负载CBD-VEGF)覆盖,缝合固定后无菌纱布绷带包扎；4.分别于术后第3d、7d、14d、21d处死动物并取样；5.各组于每个时间点拍照,计算和比较创面愈合率；6.各组于每个时间点取创缘组织行组织学观察,包括HE染色,免疫组化染色,比较各组创缘血管化程度、外源性VEGF的局部绑定能力以及创面周围细胞迁移入胶原膜片的程度；7.各组于术后第3d和第7d两个时间点,用Elisa法检测外周血VEGF的含量；结果第一部分1.C组创面愈合率在第7d、14d、21d分别为70.3%±5.4、91.9%±1.8、96.5%±1.6与A组及B组相比,C组在7d后显示出更好的创面愈合率(P<0.05或P<0.01)；2.组织学观察结果2.1 HE染色观察结果,与A组及B组相比,C组切片显示出更好的血管化程度；2.2 anti-von Willebrand factor antibody免疫组化染色结果,与A组及B组相比,C组切片表现出更多的血管计数(7d,A：3.7±1.6个、B：7.5±2.1个、C：15.3±1.6个,P<0.05或P<0.01)；2.3 anti-polyhistidine tag monoclonal antibody免疫组化染色结果,与B组相比,C组创面局部外源性VEGF的浓度明显较高(7d，B：9.7%±1.63、C：18.2%±2.71,P<0.01)3.Eiisa法检测外周血VEGF的含量,术后第7d给药后3小时和6小时两个时间点,B组大鼠外周血VEGF的含量明显高于C组(B:13.08±4.60pmol/ml 3h,4.25±2.62 pmol/ml 6h; C:0.64±0.44 pmol/ml 3h,0.60±0.45 pmol/ml 6h; p<0.01 3h; p<0.05 6h)第二部分1.扫描电镜显示该胶原材料具有多孔疏松的三维空间结构,孔隙范围在20μm至200μm之间；2.D组创面愈合率在第7d、14d、21d分别为74.1%±3.4、90.7%±1.2、98.3%±1.4与A组、B组及C组相比,D组在7d后显示出更好的创面愈合率(P<0.05或P<0.01)；3.组织学观察结果3.1 HE染色观察结果,与B组及C组相比,D组切片表现出更好的血管化程度及细胞迁移的程度；3.2 anti-von Willebrand factor antibody免疫组化染色结果,与B组及C组相比,D组切片表现出更多的血管数(7d,B：5.1±1.37个、C：10.4±1.43个、D：18.7±2.01个,P<0.05或P<0.01)；3.3 anti-polyhistidine tag monoclonal antibody免疫组化染色结果,与C组相比,D组创面局部外源性VEGF的浓度明显较高(7d, C：2.9%±1.16、D：13.4%±2.03,P<0.01)4.Elisa检测外周血VEGF的含量,术后第3d,C组大鼠外周血VEGF的含量明显高于其余各组(A:0.17±0.09pmol/ml, B:0.18±0.09 pmol/ml; C:8.30±2.09 pmol/ml, D: 0.25±0.06 pmol/ml; p<0.01,3d)结论1.胶原绑定VEGF (CBD-VEGF)能够有效地促进糖尿病溃疡创面的愈合；2.胶原绑定VEGF (CBD-VEGF)能够在创面局部形成较高的外源性VEGF浓度,从而发挥持久靶向作用；3.绑定外源性VEGF的I型胶原制成的蛋白溶液和胶原膜片均对糖尿病大鼠溃疡创面的愈合起到了较好的促进作用。