经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者介入治疗的一个重要组成部分。然而,血运重建使心肌组织遭受心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤从而导致不良的临床结果。心肌细胞凋亡是心肌缺血/再灌注损伤的重要机制之一,越来越多的证据表明,糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)在心肌细胞凋亡过程中起到关键作用,因此,通过干预GSK-3β成为对抗心脏I/R损伤的新策略。GSK-3属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,在心脏各种病理过程如心肌肥厚和缺血性损伤中发挥着重要的作用。GSK-3由两个不同的基因编码亚型α和β组成并广泛表达。许多研究证实,在心脏保护机制中发挥主要作用的是GSK-3β而不是GSK-3α。mi RNAs(micro RNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,长约20~25个核苷酸。mi RNAs通过碱基互补配对的方式结合靶messenger RNA(m RNA),降解或阻断靶m RNA的翻译。多项研究表明,增加mi R-199a-5p表达对改善心力衰竭和心房颤动等心脏疾病的病理生理改变有积极的促进作用。因此,靶向干预mi R-199a-5p可能成为治疗I/R损伤的有效靶点。他汀类药物可以预防心力衰竭、急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS),降低心血管病风险。本课题组前期实验已证实,他汀类药物预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤,然而,他汀类药物心脏保护作用的重要分子机制尚未完全阐明。因此我们推测,他汀类药物可能通过mi R-199a-5p/GSK-3β通路抑制细胞凋亡从而起到的心肌I/R损伤的保护作用。本研究通过建立心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型模拟心肌I/R损伤,检测GSK-3βm RNA和蛋白表达水平的变化以验证阿托伐他汀(atorvastatin,Ator)对H9c2心肌细胞和新生大鼠原代心肌细胞的作用。此外,我们首次发现了阿托伐他汀对mi R-199a-5p表达的调控以及mi R-199a-5p对GSK-3β基因表达的干预。于是我们进一步分析阿托伐他汀对心肌I/R损伤的作用机制,为心肌I/R损伤的预防和临床治疗提供了理论依据和新的干预靶点。第一部分阿托伐他汀预处理对大鼠原代心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其机制研究目的:探讨阿托伐他汀预处理对大鼠原代心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用,以及阿托伐他汀是否通过靶向GSK-3β发挥心肌保护的作用。方法:选择出生1~3天的SD大鼠,通过氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟心肌缺血再灌注损伤,给予心肌细胞氧糖剥夺6 h,再灌注1h处理。实验分组:1)control组:使用含10%FBS的DMEM高糖培养基,5%CO2,37℃培养箱中培养的原代心肌细胞。2)OGD/R组:氧糖剥夺6 h,再灌注1h。3)Ator+OGD/R组:在进行OGD/R前,更换Ator浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞3h,用PBS清洗细胞,然后进行氧糖剥夺再灌注。4)Li Cl+Ator+OGD/R组:使用Li Cl浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞1h,用PBS清洗细胞,更换Ator浓度为1μM的DMEM预处理细胞3h,用PBS清洗细胞,然后进行氧糖剥夺再灌注。5)Li Cl+OGD/R组:使用Li Cl浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞1h,用PBS清洗细胞,然后进行氧糖剥夺再灌注。心肌细胞缺血再灌注后,通过MTS检测细胞活性,检测乳酸脱氢酶(LDH)含量判断细胞损伤情况,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白表达以及GSK-3β蛋白表达。利用实时定量PCR法检测GSK-3βm RNA和mi R-199a-5p表达。结果:1 Ator预处理对心肌细胞GSK-3β蛋白和m RNA表达的影响。Western blot法检测GSK-3β蛋白表达,结果显示,与control组相比,OGD/R组心肌细胞GSK-3β蛋白表达水平明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组GSK-3β蛋白表达水平较OGD/R组显著升高(P<0.05)。应用实时定量PCR法,以β-actin作为内参进行相对定量。结果显示,与control组相比,OGD/R组心肌细胞GSK-3βm RNA表达水平明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组GSK-3βm RNA表达水平较OGD/R组显著升高(P<0.05)。2预处理Ator对原代心肌细胞活力的影响通过MTS测定心肌细胞活力,心肌细胞氧糖剥夺再灌注可导致明显的心肌细胞活力下降。与OGD/R组相比,Ator预处理组明显增加了心肌细胞活力(P<0.05)。加入GSK-3β抑制剂Li Cl和Ator共同预处理细胞组,Li Cl取消了Ator对心肌细胞的保护作用(P<0.05)。与OGD/R组相比较,加入Li Cl后再进行氧糖剥夺再灌注对心肌细胞活力无明显影响(P>0.05)。3预处理Ator对原代心肌细胞LDH的影响检测心肌细胞培养基中的LDH含量,与control组相比,OGD/R组心肌细胞培养基中LDH水平上升明显,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组LDH水平较OGD/R组降低显著(P<0.05)。加入Li Cl和Ator共同预处理细胞组,Li Cl取消了Ator预处理降低LDH水平的作用(P<0.05)。与OGD/R组相比较,单独给予Li Cl对心肌细胞LDH释放无明显影响(P>0.05)4 Ator预处理对原代心肌细胞凋亡相关蛋白Caspase9、B细胞淋巴因子-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyto C)的影响。Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达,与control组相比,OGD/R组心肌细胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达明显上升,Ator预处理组Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达较OGD/R组减少(P<0.05)。与Ator预处理组相比,Li Cl+Ator组Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达升高(P<0.05)。说明Li Cl抵消了Ator预处理对心肌细胞OGD/R的保护作用。5 Ator预处理对心肌细胞mi R-199a-5p表达的影响。mi R-199a-5p在心肌细胞OGD/R损伤后以及Ator预处理后的损伤中表达变化明显,为了研究mi R-199a-5p在Ator的心肌保护中的作用,应用实时定量PCR方法,以U6作为内参进行相对定量。结果显示,与control组相比,OGD/R组心肌细胞mi R-199a-5p表达水平明显上升,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组mi R-199a-5p表达水平较OGD/R组降低显著(P<0.05)。结论:1 Ator预处理减轻心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。2 Ator预处理通过上调GSK-3β起到心肌细胞OGD/R损伤的保护作用。3 mi R-199a-5p在心肌细胞OGD/R后表达升高,而在Ator预处理的OGD/R后表达下降,可进一步研究mi R-199a-5p在Ator预处理减轻心肌细胞OGD/R损伤中的作用。第二部分阿托伐他汀预处理通过上调GSK-3β减轻H9C2心肌细胞缺血再灌注损伤目的:探讨阿托伐他汀预处理是否通过调节GSK-3β对H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤起到保护作用,以及mi R-199a-5p在Ator预处理减轻H9C2细胞OGD/R损伤中的作用。方法:使用大鼠H9C2心肌细胞系传代培养,通过氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟心肌缺血再灌注损伤,经历氧糖剥夺6 h,再灌注1h处理。实验分组:1)control组:使用含10%FBS的DMEM高糖培养基,5%CO2,37℃培养箱中培养的H9C2细胞。2)OGD/R组:氧糖剥夺6 h,再灌注1h。3)Ator+OGD/R组:在进行OGD/R前,更换Ator浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞3h,用PBS清洗细胞,然后进行OGD/R。4)Li Cl+Ator+OGD/R组:使用Li Cl浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞1h,用PBS清洗细胞,更换Ator浓度为1μM的DMEM预处理细胞3h,用PBS清洗细胞,然后进行OGD/R。5)Li Cl+OGD/R组:使用Li Cl浓度为1μM的DMEM高糖培养基孵育细胞1h,用PBS清洗细胞,然后进行OGD/R。H9C2细胞缺血再灌注后,通过MTS检测细胞活性,检测乳酸脱氢酶(LDH)含量判断细胞损伤情况,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白表达以及GSK-3β蛋白表达。利用实时定量PCR法检测GSK-3βm RNA和mi R-199a-5p表达。结果:1 Ator预处理对H9C2细胞GSK-3β蛋白和m RNA表达的影响。通过Western blot法检测GSK-3β蛋白表达,结果显示,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞GSK-3β蛋白表达水平明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组GSK-3β蛋白表达水平较OGD/R组显著升高(P<0.05)。应用实时定量PCR法,以β-actin作为内参进行相对定量。结果显示,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞GSK-3βm RNA表达水平明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组GSK-3βm RNA表达水平较OGD/R组显著升高(P<0.05)。2 Ator预处理对H9C2细胞活力的影响通过MTS测定H9C2细胞活力,H9C2细胞OGD/R可导致细胞活力明显下降。与OGD/R组相比,Ator预处理组明显增加了H9C2细胞活力(P<0.05)。加入GSK-3β抑制剂Li Cl和Ator共同预处理细胞组,Li Cl取消了Ator对H9C2细胞的保护作用(P<0.05)。与OGD/R组相比较,加入Li Cl后再进行氧糖剥夺再灌注对H9C2细胞活力无明显影响(P>0.05)。3 Ator预处理对H9C2细胞LDH的影响检测H9C2细胞培养基中的LDH含量,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞培养基中LDH水平上升明显,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组LDH水平较OGD/R组降低显著(P<0.05)。加入GSK-3β抑制剂Li Cl和Ator共同预处理细胞组,Li Cl取消了Ator预处理降低LDH水平的作用(P<0.05)。与OGD/R组相比较,单独给予Li Cl对H9C2细胞LDH释放无明显影响(P>0.05)。4 Ator预处理对H9C2细胞凋亡相关蛋白Caspase9、Bcl-2、Cyto C的影响。Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达明显上升(P<0.05),Ator预处理组Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达较OGD/R组减少。与Ator预处理组相比,Li Cl+Ator组Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达升高(P<0.05)。说明Li Cl抵消了Ator预处理对H9C2细胞OGD/R的保护作用。5 Ator预处理对H9C2细胞mi R-199a-5p表达的影响。mi R-199a-5p在H9C2细胞OGD/R损伤后表达增高,而在Ator预处理后的损伤中表达减少。为了研究mi R-199a-5p在Ator的心肌保护中的作用,应用实时定量PCR方法,以U6作为内参进行相对定量。结果显示,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞mi R-199a-5p表达水平明显上升,两者具有显著性差异(P<0.05)。Ator预处理组mi R-199a-5p表达水平较OGD/R组降低显著(P<0.05)。结论:1 Ator预处理减轻H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤。2 Ator预处理通过上调GSK-3β起到H9C2细胞OGD/R损伤的保护作用。3 OGD/R组mi R-199a-5p高表达GSK-3β低表达,而在Ator预处理组mi R-199a-5p低表达GSK-3β高表达,可进一步研究mi R-199a-5p对GSK-3β是否存在转录后调控,以及mi R-199a-5p在Ator预处理减轻H9C2细胞OGD/R损伤中的作用。第三部分阿托伐他汀预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用通过抑制 mi R-199a-5p目的:探讨mi R-199a-5p与GSK-3β之间的相互作用关系以及mi R-199a-5p在Ator预处理减轻H9C2细胞OGD/R损伤中的作用。方法:采用大鼠H9C2心肌细胞,使用20 n M浓度mi R-199a-5p inhibitor转染细胞24h。实验分组1)control组:使用无FBS无双抗的DMEM高糖培养基,5%CO2,37℃培养箱中培养24 h的H9C2细胞。2)OGD/R组:氧糖剥夺6 h,再灌注1h。3)mi R-199a-5p inhibitor+OGD/R组:在进行OGD/R前,经过mi R-199a-5p inhibitor转染24h,然后进行氧糖剥夺再灌注。4)mi R-199a-5p inhibitor组:正常培养的细胞,经过mi R-199a-5p inhibitor转染24h后,恢复正常培养。使用RT-PCR法确认mi RNA转染效率,通过MTS检测细胞活性,检测乳酸脱氢酶(LDH)含量判断细胞损伤情况,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白表达以及GSK-3β蛋白表达。利用实时定量PCR法检测GSK-3βm RNA和mi R-199a-5p表达。采用免疫荧光技术检测GSK-3β蛋白表达。结果:1细胞转染效率通过RT-PCR法检测mi R-199a-5p的表达,以确定细胞转染成功。相对于未转染对照组和阴性转染组,转染mi R-199a-5p mimic可导致H9C2细胞中mi R-199a-5p的表达明显上升,两者具有显著性差异(P<0.05),转染mi R-199a-5p inhibitor可导致H9C2细胞中mi R-199a-5p的表达明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05),说明细胞转染成功。2细胞转染对基因表达的影响2.1转染mi R-199a-5p mimic和mi R-199a-5p inhibitor对GSK-3βm RNA水平的影响相对于未转染对照组和阴性转染组,转染mi R-199a-5p mimic可导致H9C2细胞中GSK-3βm RNA的表达明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05),转染mi R-199a-5p inhibitor可导致H9C2细胞中GSK-3βm RNA的表达明显上升,两者具有显著性差异(P<0.05)。2.2转染mi R-199a-5p mimic和mi R-199a-5p inhibitor对GSK-3β蛋白水平的影响转染mi R-199a-5p mimic后H9C2细胞中GSK-3β蛋白表达水平较对照组明显下降(P<0.05),转染mi R-199a-5p inhibitor后H9C2细胞中GSK-3β蛋白表达水平较对照组显著上升(P<0.05)。提示mi R-199a-5p对GSK-3β存在转录后的基因表达调控,抑制mi R-199a-5p表达,可恢复GSK-3β活性。3 mi R-199a-5p inhibitor转染对H9C2细胞活力的影响通过MTS测定H9C2细胞活力,将各组的结果与control组相比较,进行标准化处理。H9C2细胞氧糖剥夺再灌注可导致明显的H9C2细胞活力下降。与OGD/R组相比,转染mi R-199a-5p inhibitor后再进行OGD/R组,细胞活力明显增加(P<0.05)。单纯转染mi R-199a-5p inhibitor细胞活性无明显变化。4 mi R-199a-5p inhibitor转染对H9C2细胞LDH的影响检测H9C2细胞培养基中的LDH含量,将各组的结果与control组相比较,OGD/R处理后培养基中LDH水平上升明显,两者具有显著性差异(P<0.05)。与OGD/R组相比,转染mi R-199a-5p inhibitor后再进行OGD/R组培养基中LDH水平明显降低(P<0.05)。单纯转染mi R-199a-5p inhibitor对LDH无明显影响。5 mi R-199a-5p inhibitor转染对H9C2细胞凋亡相关蛋白Caspase9、Bcl-2和Cyto C的影响。Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达明显上升(P<0.05),转染mi R-199a-5p inhibitor后再进行OGD/R组Caspase9、Bcl-2、Cyto C表达较OGD/R组减少(P<0.05)。6 mi R-199a-5p inhibitor转染对H9C2细胞GSK-3β蛋白表达的影响。实验第二部分已证实,GSK-3β在心肌缺血再灌注损伤中起到至关重要的心肌保护作用,为了研究mi R-199a-5p在OGD/R过程中如何靶向调节GSK-3β,我们通过Western blot法检测GSK-3β蛋白表达,结果显示,与control组相比,OGD/R组H9C2细胞GSK-3β蛋白表达水平明显下降,两者具有显著性差异(P<0.05);转染mi R-199a-5p inhibitor后再进行OGD/R组GSK-3β蛋白表达水平较OGD/R组显著升高(P<0.05);单纯转染mi R-199a-5p inhibitor使GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05)。免疫荧光法检测结果显示,与control组相比,OGD/R组GSK-3β荧光明显减弱;转染mi R-199a-5p inhibitor后再进行OGD/R组GSK-3β荧光表达较OGD/R组增强;单纯转染mi R-199a-5p inhibitor使GSK-3β荧光表达增强。结论:1 mi R-199a-5p调控GSK-3β转录后的基因表达,GSK-3β是mi R-199a-5p的靶基因。2抑制mi R-199a-5p表达可以对抗H9C2细胞OGD/R损伤。3抑制mi R-199a-5p通过上调靶基因GSK-3β对抗H9C2细胞OGD/R损伤。4 Ator预处理通过抑制mi R-199a-5p对抗H9C2细胞OGD/R损伤。