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壳低聚糖是壳聚糖(chitosan)经水解后产生的一类低聚合度(n一般在2~20)可溶于水的氨基糖类化合物,其化学结构是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通过β-1,4糖苷键连接起来的低聚糖。同壳聚糖大分子相比,壳低聚糖作为功能性低聚糖除了具有促进双歧杆菌的生长繁殖以外,还具有一些独特的功能性质。这些性质包括良好的水溶性、吸湿保湿性、抗菌抑菌性、抗肿瘤、降胆固醇和提高动植物的生理活性等。由于壳低聚糖所特有的各种生理活性和功能性质,使其在保健食品、生物医药、日用化妆品、医疗诊断和生物生理等方面具有独特的应用价值,因此其大规模生产将具有非常重要的经济价值。
本论文通过对硅胶G薄层—比色法检测壳低聚糖、单一酶和复合酶制备壳低聚糖、以及壳低聚糖Cr(Ⅲ)离子配合物制备等进行研究,建立了一种简便、高效、快速检测壳低聚糖含量的方法,提高了壳低聚糖的得率,并且为一种新型的降糖保健品的大规模工业化生产奠定了基础。
采用硅胶G薄层-DNS法检测壳低聚糖的含量,当展开剂为乙酸乙酯:无水乙醇:水:氨水=5:5:4:0.45、显色剂为苯胺—二苯胺—磷酸、点样量为2μg/μL时、可将壳低聚糖单糖至六糖各组分分开,斑点清晰、圆形、无拖尾,分离效果好。以硅胶G薄层—比色法检测壳低聚糖的含量,具有样品回收率高、相对误差较小、方法简便、准确性高等优点,适合于壳低聚糖常规检验。
以壳低聚糖的得率为指标,分别研究了不同因素对纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶制备壳低聚糖的影响,试验结果表明纤维素酶的最适反应条件为:温度55℃、pH4.4、底物浓度1.0%、酶用量1500U、反应时间2.5h。果胶酶的最适反应条件为:温度50℃、pH4.2、底物浓度1.0%、酶用量1500U、反应时间3.0h。β-葡聚糖酶的最适反应条件为:温度60℃、pH4.0、底物浓度1.0%、酶用量1000U、反应时间2.5h。
以壳低聚糖的得率为指标,分别研究了纤维素酶-果胶酶,纤维素酶—β-葡聚糖酶,果胶酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的影响因素,并进行了工艺优化,试验结果表明纤维素酶-果胶酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为:酶的复合比例2:1、温度55℃、pH值4.4、底物浓度1.0%、酶用量2000U、反应时间2.0h,在此条件下壳低聚糖得率为35.34%。纤维素酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为:酶的复合比例1:2、温度60℃、pH值4.4、底物浓度1.5%、酶用量2000U、反应时间2h,在此条件下壳低聚糖得率为34.22%。果胶酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为:酶的复合比例1:1、温度50℃、pH值3.8、底物浓度1.5%、酶用量1500U、反应时间3.0h,在此条件下壳低聚糖得率为29.78%。
以壳低聚糖与铬(Ⅲ)离子配合物的得率为指标,研究反应pH值、温度、底物浓度、时间对结合率的影响,结果表明各因素对制备工艺的影响大小为:反应pH值>反应时间>反应温度>底物浓度。并采用正交试验进行了工艺优化,最优工艺为反应pH8.5、反应时间3.5h、反应温度45℃、底物浓度为8%,在此条件下,壳低聚糖与Cr(Ⅲ)离子配合物结合率可达25.04%。对制备的配合物的结构进行了红外光谱、紫外-可见光谱分析,研究结果表明,壳低聚糖与铬(Ⅲ)离子能形成稳定的配合物,经红外、紫外光谱分析其配位的基团是-NH2基。