老年性痴呆(Alzheimerdisease，AD)是以认知功能障碍为主的中枢神经系统慢性退行性疾病。它的主要病理特征是脑内细胞外老年斑沉积、细胞内神经纤维缠结以及神经元丢失。关于AD的发病机制有多种假说，而其中的Aβ毒性学说是大多数人所认可的。 针对Aβ与AD的关系，人们提出了AD的免疫治疗。1999年Schenk等人用Aβ42免疫治疗AD转基因动物模型，产生了特异性的抗Aβ42抗体，阻止和减少了淀粉样斑块的形成，而且提高接种鼠的认知能力。随后其他实验室也证实Aβ42免疫的有效性。但是2002年以Aβ42为疫苗的临床Ⅱ期实验中，约6％病人出现了脑膜脑炎症状。分析认为，Aβ42肽C末端的T细胞表位激发了Th1反应从而出现炎症反应。因此在随后的研究中，为了避免T细胞抗原表位激发的Th1反应，研究者又提出用Aβ亚单位疫苗治疗AD。 在实验室的前期工作基础上，本实验优化制备和纯化了Aβ亚单位疫苗。在设计时为了避免细胞免疫反应保证强的体液免疫反应，去除了Aβ的T细胞抗原表位保留了Aβ的B细胞抗原表位，并用多个重复B细胞抗原表位增加抗原的免疫原性；去除了目的基因前面的一段载体序列。选用更理想的纯化标签和载体来优化构建原核表达载体，使能更快速和简便纯化获得目的蛋白。 材料与方法 1.原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-O的优化构建及鉴定 根据人Aβ42的第1-15个氨基酸序列即Aβ1-15的氨基酸序列，选用大肠杆菌优选密码子，设计目的基因序列。目的基因序列用柔性肽连接四个Aβ1-15组成，前面两个Aβ1-15和后面两个Aβ1-15都是由两个甘氨基酸即Gly-Gly连接，中间的两个Aβ1-15之间由甘氨酸和丝氨基酸即Gly-Ser-Ser-Gly连接。用两对引物分别扩增前面两个Aβ1-15和后面两个Aβ1-15，获得基因片断。将两个目的基因片段纯化后分别克隆入pGEM-TEasy载体，转化感受态细菌后挑取阳性菌落扩大培养，基因测序及提取质粒酶切鉴定得到重组质粒。将从阳性重组质粒中纯化酶切出的目的基因片段后面两个Aβ1-15克隆入原核表达质粒pQE-30a中，转化至感受态细菌挑取阳性克隆培养，提取质粒经酶切鉴定得到阳性重组载体。之后纯化酶切出目的基因片段前面两个Aβ1-15，和用同样的酶酶切纯化的后面两个Aβ1-15和质粒pQE-30的阳性重组载体，在连接酶的作用下连接，转化至感受态细菌EcoliDH5α挑取阳性克隆培养，提取质粒酶切鉴定得到重组表达载体pQE-4×Aβ1-15-O。 2.重组表达载体pQE-4×Aβ1-is-O的原核表达 制备E.coliM15感受态细胞，从E.coliDH5α菌中提取重组原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-O，纯化后转化入E.coliM15中，优化表达条件，用1mmol/L的IPTG浓度和在30℃条件下诱导表达，表达后超声破碎裂解菌体，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳及Western-Blotting鉴定。 3.目的蛋白的小量纯化及鉴定 培养100ml细菌诱导表达，表达后超声破碎裂解菌体，用his-tagNi2+亲和纯化树脂进行金属亲和层析纯化获得目的蛋白4×Aβ1-15，将目的蛋白用SDS-PAGE电泳观察其纯度，用Western-Blotting鉴定其免疫反应性。 结果 1.构建了原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-OPCR扩增获得目的基因片断1-2×Aβ1-15和2-2×Aβ1-15，目的基因片断T/A克隆后酶切和测序鉴定得到阳性重组载体pGEM-T-1-2×Aβ1-15和pGEM-T-2-2×Aβ1-15。从pGEM-T-2-2×Aβ1-15酶切得到的2-2×Aβ1-15连接到pQE-30a上的到阳性重组载体pQE-30-2-2×Aβ1-15。酶切pGEM-T-1-2×Aβ1-15后获得的1-2×Aβ1-15和用相同的酶酶切的pQE-30-2-2×Aβ1-15连接，获得阳性重组载体pQE-4×Aβ1-15-O。 2.pQE-4×Aβ1-15-O表达目的蛋白 pQE-4×Aβ1-15-O在E.coliM15中诱导表达的产物SDS-PAGE电泳显示，目的蛋白主要呈可溶性表达，约占细菌总蛋白的15％。目的蛋白条带在SDS-PAGE中显示的相对分子质量约为21KD，比理论计算的相对分子质量9.1KD大。 3.纯化获得有免疫反应性的目的蛋白pQE-4×Aβ1-15-O在E.coliM15中诱导表达的产物用his-tagNi2+亲和纯化树脂纯化后，SDS-PAGE电泳显示在21KD左右的单一目的条带，证实纯化后基本去除了杂蛋白。纯化后的蛋白Western-Blotting显示21KD左右有单一条带，表明表达的目的蛋白能和抗Aβ42的抗体特异性结合，具有免疫反应性。 结论 1.利用基因工程的原理成功优化构建了重组pQE-4×Aβ1-15-O原核表达载体。 2.成功表达了带his标签的4×Aβ1-15蛋白，并优化纯化制备了四价串联B细胞表位的4×Aβ1-15蛋白。 3.通过Western-blotting显示，原核表达制备的4×Aβ1-15蛋白可和抗Aβ42的抗体特异性结合。