细胞膜作为细胞与外界的屏障,在维持细胞的稳定、物质运输、信号转导等过程中发挥着非常重要的作用。细胞膜结构和膜组成分子的异常化是许多疾病发生的关键因素。因此,解析细胞膜表面分子的分布及组装机理对于理解其生理功能及病理过程至关重要。为了在亚细胞结构内实现对生物分子分布的认知,直接观测是最有效便捷的方法。然而,这些分子的尺寸大多数在衍射极限以下,普通光学显微镜不能满足要求。近年来发展的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在研究细胞膜分布、解析生物结构、揭示分子相互作用等方面做出了巨大贡献。其中,直接随机光学重构显微镜(direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM)由于较高的分辨率和便捷的操作而得到广泛应用。dSTORM技术基于单个荧光分子的定位,需要成千上万张原始图片来重构一张超分辨图像,因此,超分辨图像的质量与获得的定位点密度和定位精度密切相关。为了获得更准确的超分辨图像,需要探针的精确定位和高密度识别。理想的探针应该是小尺寸、单价态、高特异性以及对靶标较小的干扰。传统的探针,例如抗体,尺寸相对较大且为多价态,在识别目标分子时存在潜在的空间位阻与交联。近期出现的一些小分子探针为单分子标记开拓了一个新思路。我们利用dSTORM技术,结合小分子探针标记,对细胞膜上多种糖分子及膜蛋白的分布模式进行了研究,取得的主要研究结果如下:1.糖分子结构复杂且多样化,在标记时通常以凝集素作为探针,然而凝集素为多价态,在标记糖分子时容易引起交联。为了避免这一现象,我们选用适配体探针标记糖分子。以N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)为例,GalNAc是细胞膜上一种重要的O连接糖,传统识别GalNAc探针为大豆凝集素(SBA),我们用一种特异性的适配体识别GalNAc,结合dSTORM技术,对GalNAc在细胞膜上的分布进行超分辨成像,并分别检测了适配体探针和凝集素的标记效率和识别特异性。结果表明,GalNAc在细胞膜上形成异质团簇,而且用适配体标记时形成的团簇比凝集素标记时具有更多的定位点,表明适配体在糖簇内具有更强的分子识别能力。此外,通过糖苷酶去除GalNAc,证明适配体比凝集素具有更好的特异性。这一工作表明适配体是标记膜糖分子的高效探针,可以提供更准确、更详细的糖分子的空间定位信息。2.Globo H是细胞膜上一种与癌症相关的糖分子,在多种癌症中过表达。目前为止,globo H在分子水平上的准确定位和详细分布形态仍不清楚。Globo H的抗体为一种IgM,不仅尺寸较大,而且较难获得。因此,我们利用适配体探针识别细胞膜上的globo H,并结合超分辨显微镜研究了 globo H的分布特征。通过分析发现globo H在癌细胞膜上形成大小不一的团簇,并且globo H的高表达和成簇分布是癌细胞上特有的,表明globo H可以作为潜在的癌症诊断标志物。另外,双色dSTORM成像显示globo H与另外两种癌症相关的糖分子唾液酸(sia)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)存在共定位关系,我们推测这些与癌症相关的糖分子可能在某些癌症过程中协同发挥作用。这一工作对以后研究细胞膜糖分子结构与功能的关系奠定了基础。3.上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种重要的I型跨膜蛋白,在细胞功能和肿瘤发生中起着至关重要的作用。然而关于EpCAM在细胞膜上的详细形态、分子化学计量学和组装机制的问题尚未阐明。我们利用一种小分子肽来识别EpCAM,并结合超分辨显微技术,研究了 EpCAM在细胞膜上的组装机理。与抗体标记相比较,肽标记的方法显示了高的标记效率和定位密度;同时我们发现EpCAM在细胞膜上组装成含有不同个数蛋白分子的团簇;双色dSTORM成像显示了 EpCAM在一定程度上与四跨膜蛋白CD9共定位,CD9基因沉默能明显削弱EpCAM的聚集程度,表明EpCAM可能定位在细胞膜上的四跨膜蛋白富集微结构域(TEM);与此同时,通过细胞松弛素D和糖苷酶NAG处理证明细胞骨架和糖基化也是EpCAM成簇的关键因素。这一体系为以后膜蛋白纳米结构域的研究提供新的线索。4.核仁素(NCL)在细胞膜上作为一种受体蛋白,不仅在细胞膜上表达,而且广泛分布于细胞核与细胞质中。尽管NCL被发现具有多种生物功能,但是其在细胞各个组分中的分布形态尚未获得。此外,胞质内和核内的蛋白在用抗体标记时通常需要透化,透化这一过程对细胞膜和核膜都有一定程度的破坏,影响对蛋白的原位观察。因此,我们用一种特异性适配体AS1411标记NCL,利用dSTORM技术揭示了 NCL在核仁、核质和细胞质中的不同分布模式,并对NCL在癌细胞和正常细胞的不同细胞组分中的分布进行了比较。结果表明,AS1411可以渗透进细胞内识别胞质中和核内的蛋白,无需进行透化,并且定位点密度高于抗体;通过分析发现,NCL在核仁中定位密度最高,在细胞质中以簇形态分布;与正常细胞相比,NCL在癌细胞膜表面和胞质中表达上调并且形成更大的簇,暗示这种表达和分布的变化可能与细胞癌变过程密切相关。5.前列腺特异性膜抗原(PSMA)是细胞膜上一种重要的癌症标志物,不仅参与多种细胞活动,而且具有羧肽酶和叶酸水解酶的性质。因此,基于PSMA独特的酶性质发展出许多抑制剂。我们利用抑制剂具有高特异性的识别特点,发展了一种基于抑制剂的超分辨探针,用于PSMA的超分辨成像。小分子抑制剂探针显示出比抗体更高的标记密度和簇识别能力。通过数据分析,我们发现PSMA在细胞膜上以簇的形式分布;双色dSTORM成像显示出PSMA与叶酸受体的显著共定位,暗示了这两种蛋白可能在叶酸转运中起协同作用。这一研究有助于进一步理解PSMA的生物学功能。更重要的是,基于小分子抑制剂开发的荧光探针扩展了超分辨成像探针的领域。