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表达在细胞膜上的跨膜型TNF-α(tmTNF-α)可在TACE的作用下，水解胞外段产生分泌型TNF-α(sTNF-α)。tmTNF-α既可以作为配体向靶细胞传递正向信号，也可作为受体向表达tmTNF-α的细胞自身传递反向信号。本课题组前期研究发现：多种白血病细胞高表达tmTNF-α，且其与白血病细胞的耐药和不良预后有明显相关性，并证实tmTNF-α可通过反向信号组成性活化NF-κB促进其存活和抗凋亡的。但是，tmTNF-α活化NF-κB的分子机制尚不清楚。本研究旨在进一步探索tmTNF-α组成性活化NF-κB经典及非经典途径的分子机制及其对白血病耐药的影响。其主要结果如下：
I.tmTNF-α反向信号激活白血病细胞NF-κB经典和非经典途径
1.tmTNF-α对白血病细胞耐药的影响
为进一步明确tmTNF-α与白血病细胞耐药的关系，我们构建了稳转tmTNF-α的Jurkat细胞，高表达tmTNF-α的Jurkat细胞对DOX的敏感性较不表达tmTNF-α的Jurkat细胞明显降低，提示tmTNF-α可导致白血病细胞耐药。
2.抑制tmTNF-α反向信号对白血病细胞NF-κB非经典和经典途径的影响
将tmTNF-α和tmTNF-α-LS(该突变体缺失sTNF-α段，不能与TNFR结合，只保留胞浆段，仅传递tmTNF-α反向信号)稳定转染L82白血病细胞，结果证实转染tmTNF-α-LS与转染tmTNF-α一样，可明显导致p100和IκB-α的降解。分别用CK1抑制剂D4476和磷酸酶抑制剂LB100分别抑制tmTNF-α的磷酸化(促进其反向信号)和脱磷酸化(抑制其反向信号)，结果发现，D4476可促进L82-TNF和L82-LS细胞中p100和IκB-α的降解，而LB100可抑制L82-TNF和L82-LS细胞中p100和IκB-α的降解。上述结果提示tmTNF-α是通过其反向信号激活NF-κB非经典和经典途径的。
II.tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径的分子机制
1tmTNF-α通过NIK依赖性方式激活NF-κB经典途径
1.1NIK参与tmTNF-α激活NF-κB经典途径
将TRAF1和NIK分别转染以及共转染稳转tmTNF-α的HEK293T细胞和野生型HEK293T细胞，WB结果证实只有在tmTNF-α和TRAF1共同存在的情况下，NIK才能发挥明显地促进IκBα降解和p65磷酸化的作用，提示NIK参与tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径。反之，用siRNA敲降Raji细胞NIK的表达，WB证实tmTNF-α诱导的IκBα和p100的降解以及p65的磷酸化均受到抑制，证实NIK可同时参与tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典和非经典途径。
1.2抑制NIK表达不影响sTNF-α激活NF-κB经典途径
用sTNF-α处理高表达tmTNF-α的Raji细胞，结果发现sTNF-α能明显促进IκBα的降解和p65的磷酸化，用siRNA敲降Raji细胞NIK的表达，并不能阻止sTNF-α活化NF-κB的经典途径。
1.3抑制NIK表达可提高Raji细胞对DOX的敏感性
分别用不同浓度的DOX作用高表达tmTNF-α的Raji细胞后，用CCK8检测杀伤效应，结果证实：用siRNA抑制NIK的表达，可提高Raji细胞对不同剂量DOX的敏感性。
2NIK通过IKKα介导tmTNF-α诱导的NF-κB经典途径的活化
2.1IKKα可以与IκBα结合并导致其磷酸化
由于IKKα是NIK的底物，为观察IKKα是否导致IκBα磷酸化，我们用IKKα抗体做IP/WB，结果证实IKKα可以与NIK和磷酸化IκBα发生免疫共沉淀，用IKKβ磷酸化抑制剂IMD0354尽管使共沉淀的磷酸化IκBα减少，但仍然有部分IκBα发生磷酸化，提示NIK活化的IKKα可直接结合IκBα，并导致其磷酸化。
2.2沉默IKKα抑制IKKβ非依赖的IκBα的磷酸化和降解
分别或联用IKKαsiRNA以及IKKβ抑制剂IMD0354处理高表达tmTNF-α的Raji细胞，WB结果证实：单独抑制IKKα和IKKβ均可部分抑制IκBα的磷酸化和降解，同时靶向IKKα和IKKβ的抑制作用更强，提示二者对IκBα均有促磷酸化和降解作用。
3tmTNF-α通过NIK非依赖性方式激活NF-κB经典途径
3.1IKKβ参与tmTNF-α激活NF-κB经典途径
分别或联用NIKsiRNA以及IKKβ磷酸化抑制剂IMD0354处理Raji细胞，WB结果证实：抑制NIK的表达或IKKβ磷酸化均可部分减少IκBα的降解和p65的磷酸化，二者联用的抑制效果更显著，提示tmTNF-α可通过NIK非依赖性途径激活IKKβ／NF-κB经典途径。分别用不同浓度的DOX作用高表达tmTNF-α的Raji细胞24小时后，结果证实：用IMD0354抑制IKKβ磷酸化，可提高Raji细胞对较高剂量DOX的敏感性。
3.2tmTNF-α通过Akt信号通路激活NF-κB经典途径
用WB分别检测tmTNF-α阳性和阴性的白血病细胞Akt的磷酸化，结果表明，仅tmTNF-α+的白血病细胞Akt发生磷酸化。用PI3K/Akt抑制剂LY294002可明显抑制tmTNF-α阳性，而非tmTNF-α阴性，白血病细胞的IκBα的磷酸化和降解。
III.tmTNF-α反向信号激活NF-κB非经典途径的分子机制
1TRAF1截断突变体的原核表达质粒的构建
通过PCR技术构建TRAF1及其截断突变体的原核表达质粒：TRAF1-pet28a、TRAF1(1-164)-pet28a、TRAF1(165-416)-pet28a。
2TRAF1与tmTNF-α结合的结构域
成功构建了TRAF1第22-57aa锌指结构域缺失突变体Del(22-57)TRAF1-REDN1，与前期构建的全长TRAF1的真核表达质粒转染至稳转tmTNF-α的HEK293T细胞中，用实验室自制的tmTNF-α抗体做免疫共沉淀，结果表明，WT-TRAF1能够与tmTNF-α结合，而缺失锌指结构域的TRAF1则不能与tmTNF-α结合，提示TRAF1的锌指结构域是TRAF1和tmTNF-α胞浆段的结合部位。
总结：本研究主要阐明了tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径的分子机制，即通过TRAF1/NIK/IKKα直接激活，并通过Akt途径间接激活NF-κB经典途径。本研究不但揭示了白血病细胞中NF-κB持续性活化导致耐药的新机制，还为靶向干扰tmTNF-α通路，阻断白血病细胞耐药提供新的治疗靶点与线索。
I.tmTNF-α反向信号激活白血病细胞NF-κB经典和非经典途径
1.tmTNF-α对白血病细胞耐药的影响
为进一步明确tmTNF-α与白血病细胞耐药的关系，我们构建了稳转tmTNF-α的Jurkat细胞，高表达tmTNF-α的Jurkat细胞对DOX的敏感性较不表达tmTNF-α的Jurkat细胞明显降低，提示tmTNF-α可导致白血病细胞耐药。
2.抑制tmTNF-α反向信号对白血病细胞NF-κB非经典和经典途径的影响
将tmTNF-α和tmTNF-α-LS(该突变体缺失sTNF-α段，不能与TNFR结合，只保留胞浆段，仅传递tmTNF-α反向信号)稳定转染L82白血病细胞，结果证实转染tmTNF-α-LS与转染tmTNF-α一样，可明显导致p100和IκB-α的降解。分别用CK1抑制剂D4476和磷酸酶抑制剂LB100分别抑制tmTNF-α的磷酸化(促进其反向信号)和脱磷酸化(抑制其反向信号)，结果发现，D4476可促进L82-TNF和L82-LS细胞中p100和IκB-α的降解，而LB100可抑制L82-TNF和L82-LS细胞中p100和IκB-α的降解。上述结果提示tmTNF-α是通过其反向信号激活NF-κB非经典和经典途径的。
II.tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径的分子机制
1tmTNF-α通过NIK依赖性方式激活NF-κB经典途径
1.1NIK参与tmTNF-α激活NF-κB经典途径
将TRAF1和NIK分别转染以及共转染稳转tmTNF-α的HEK293T细胞和野生型HEK293T细胞，WB结果证实只有在tmTNF-α和TRAF1共同存在的情况下，NIK才能发挥明显地促进IκBα降解和p65磷酸化的作用，提示NIK参与tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径。反之，用siRNA敲降Raji细胞NIK的表达，WB证实tmTNF-α诱导的IκBα和p100的降解以及p65的磷酸化均受到抑制，证实NIK可同时参与tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典和非经典途径。
1.2抑制NIK表达不影响sTNF-α激活NF-κB经典途径
用sTNF-α处理高表达tmTNF-α的Raji细胞，结果发现sTNF-α能明显促进IκBα的降解和p65的磷酸化，用siRNA敲降Raji细胞NIK的表达，并不能阻止sTNF-α活化NF-κB的经典途径。
1.3抑制NIK表达可提高Raji细胞对DOX的敏感性
分别用不同浓度的DOX作用高表达tmTNF-α的Raji细胞后，用CCK8检测杀伤效应，结果证实：用siRNA抑制NIK的表达，可提高Raji细胞对不同剂量DOX的敏感性。
2NIK通过IKKα介导tmTNF-α诱导的NF-κB经典途径的活化
2.1IKKα可以与IκBα结合并导致其磷酸化
由于IKKα是NIK的底物，为观察IKKα是否导致IκBα磷酸化，我们用IKKα抗体做IP/WB，结果证实IKKα可以与NIK和磷酸化IκBα发生免疫共沉淀，用IKKβ磷酸化抑制剂IMD0354尽管使共沉淀的磷酸化IκBα减少，但仍然有部分IκBα发生磷酸化，提示NIK活化的IKKα可直接结合IκBα，并导致其磷酸化。
2.2沉默IKKα抑制IKKβ非依赖的IκBα的磷酸化和降解
分别或联用IKKαsiRNA以及IKKβ抑制剂IMD0354处理高表达tmTNF-α的Raji细胞，WB结果证实：单独抑制IKKα和IKKβ均可部分抑制IκBα的磷酸化和降解，同时靶向IKKα和IKKβ的抑制作用更强，提示二者对IκBα均有促磷酸化和降解作用。
3tmTNF-α通过NIK非依赖性方式激活NF-κB经典途径
3.1IKKβ参与tmTNF-α激活NF-κB经典途径
分别或联用NIKsiRNA以及IKKβ磷酸化抑制剂IMD0354处理Raji细胞，WB结果证实：抑制NIK的表达或IKKβ磷酸化均可部分减少IκBα的降解和p65的磷酸化，二者联用的抑制效果更显著，提示tmTNF-α可通过NIK非依赖性途径激活IKKβ／NF-κB经典途径。分别用不同浓度的DOX作用高表达tmTNF-α的Raji细胞24小时后，结果证实：用IMD0354抑制IKKβ磷酸化，可提高Raji细胞对较高剂量DOX的敏感性。
3.2tmTNF-α通过Akt信号通路激活NF-κB经典途径
用WB分别检测tmTNF-α阳性和阴性的白血病细胞Akt的磷酸化，结果表明，仅tmTNF-α+的白血病细胞Akt发生磷酸化。用PI3K/Akt抑制剂LY294002可明显抑制tmTNF-α阳性，而非tmTNF-α阴性，白血病细胞的IκBα的磷酸化和降解。
III.tmTNF-α反向信号激活NF-κB非经典途径的分子机制
1TRAF1截断突变体的原核表达质粒的构建
通过PCR技术构建TRAF1及其截断突变体的原核表达质粒：TRAF1-pet28a、TRAF1(1-164)-pet28a、TRAF1(165-416)-pet28a。
2TRAF1与tmTNF-α结合的结构域
成功构建了TRAF1第22-57aa锌指结构域缺失突变体Del(22-57)TRAF1-REDN1，与前期构建的全长TRAF1的真核表达质粒转染至稳转tmTNF-α的HEK293T细胞中，用实验室自制的tmTNF-α抗体做免疫共沉淀，结果表明，WT-TRAF1能够与tmTNF-α结合，而缺失锌指结构域的TRAF1则不能与tmTNF-α结合，提示TRAF1的锌指结构域是TRAF1和tmTNF-α胞浆段的结合部位。
总结：本研究主要阐明了tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径的分子机制，即通过TRAF1/NIK/IKKα直接激活，并通过Akt途径间接激活NF-κB经典途径。本研究不但揭示了白血病细胞中NF-κB持续性活化导致耐药的新机制，还为靶向干扰tmTNF-α通路，阻断白血病细胞耐药提供新的治疗靶点与线索。