论文部分内容阅读
胚胎植入包括胚泡在子宫内膜的定位、黏附和侵入等环节。研究表明,70%的不孕症发生在胚胎植入阶段,且营养代谢的紊乱和生殖器官的损伤是引起胚胎异常植入的主要因素。钼作为机体必需的微量元素,是多种生物酶的活性位点,而反刍动物对钼极其敏感,过量摄入钼可引发钼中毒。大量研究证实,钼可作用于机体生殖系统,参与生殖过程的调控。本研究通过灌喂钼酸钠分别建立未怀孕绵羊钼处理模型和围植入期绵羊钼处理模型,探讨钼调控绵羊胚胎植入的分子机制。未怀孕绵羊钼处理模型:通过给绵羊灌喂不同剂量的钼酸钠（0、10、20和50 mg/kg,按绵羊体重计）,建立钼处理绵羊模型,在灌喂钼酸钠28天时,收集绵羊血液和子宫组织。采用原子吸收光谱仪检测血液中微量元素的变化;采用HE染色、透射电镜和TUNEL染色观察子宫内膜病理形态学的变化;采用免疫荧光染色和Western-blot技术检测子宫内膜基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）/组织特异性抑制剂（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs）系统相关蛋白的表达,探讨钼对绵羊子宫内膜形态学及MMPs/TIMPs系统平衡的影响。围植入期绵羊钼处理模型:通过给围植入期的绵羊灌喂不同剂量的钼酸钠（0、10和20 mg/kg,按绵羊体重计）,建立围植入期绵羊钼处理模型,在灌喂钼酸钠28天时,收集绵羊子宫组织。采用HE、PAS、AB-PAS和Masson染色评估钼处理对围植入期绵羊子宫内膜形态学及功能的影响;采用免疫荧光染色和Western-blot技术检测围植入期绵羊子宫内膜MMPs/TIMPs系统及调控MMPs/TIMPs系统上游通路相关蛋白的表达;采用免疫荧光染色评估子宫内膜容受性相关指标的蛋白表达,探究钼调控绵羊胚胎植入的分子机制。具体结果如下:1.钼对绵羊血液铜、锌、钙、镁和铁水平的影响原子吸收分光谱仪检测血液中微量元素（铜、锌、钙、镁和铁）含量发现,钼处理显著降低血液中铜水平（P＜0.05或P＜0.01）;血液中锌的水平在钼处理后呈上升趋势（P＜0.05或P＜0.01）;而钙、镁和铁的水平在钼处理后无显著性变化。2.钼损伤绵羊子宫内膜组织形态及上皮细胞超微结构HE染色结果显示,钼处理后子宫内膜上皮细胞紊乱排列,部分上皮细胞出现细胞质的丢失及细胞核皱缩或浓染,间质细胞出现染色质的丢失等病变;TUNEL染色结果显示,钼处理导致子宫内膜细胞凋亡率显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。采用透射电镜进一步观察子宫内膜上皮细胞超微结构发现,钼处理严重损伤子宫内膜上皮细胞线粒体结构,造成线粒体肿胀,空泡化及线粒体嵴的溶解或消失,同时,细胞核表现为核膜模糊不清及双层核膜的消失。以上结果表明了过量的钼摄入造成子宫内膜的病理形态学严重损伤,诱导内膜细胞凋亡的发生。3.钼打破绵羊子宫内膜MMPs/TIMPs系统平衡免疫荧光染色和Western-blot技术检测结果显示,在灌喂20和50 mg/kg钼酸钠后,MMP-2蛋白表达显著上调（P＜0.05或P＜0.01）,TIMP-2蛋白表达在钼处理后均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,MMP-2/TIMP-2比值在灌喂20和50 mg/kg钼酸钠后呈上升趋势（P＜0.05或P＜0.01）,表明钼处理扰乱了MMP-2/TIMP-2系统的平衡;MMP-9蛋白表达在钼处理后显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,TIMP-1蛋白表达在灌喂20和50 mg/kg钼酸钠后显著上调（P＜0.01）,MMP-9/TIMP-1比值在钼处理后均呈下降趋势（P＜0.01）,表明钼处理造成MMP-9/TIMP-1系统失衡;IV型胶原蛋白是评价MMP-2/TIMP-2与MMP-9/TIMP-1系统平衡的主要指标,结果发现钼处理后IV型胶原蛋白表达均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）,进一步佐证了钼具有扰乱MMP-2/TIMP-2与MMP-9/TIMP-1系统之间平衡的潜力。4.钼损伤围植入期绵羊子宫内膜形态及功能HE染色结果显示,围植入期绵羊子宫内膜上皮细胞及间质细胞在钼处理后表现为杂乱排列,细胞间隙不清及细胞质丢失;AB-PAS和PAS染色结果显示,钼处理后子宫内膜杯状细胞的数量和糖原的分泌显著减少（P＜0.01）;Masson染色结果显示,子宫内膜胶原纤维表达在钼处理后明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果证实钼处理严重损伤围植入期绵羊子宫内膜的形态结构,进而影响子宫内膜的正常屏障功能。5.钼扰乱围植入期绵羊子宫内膜MMPs/TIMPs系统平衡免疫荧光和Western-blot检测发现,在钼处理后MMP-2蛋白表达均显著下调（P＜0.01）,而TIMP-2蛋白表达无显著性变化,MMP-2/TIMP-2比例均呈下降趋势（P＜0.01）;MMP-9蛋白表达在钼处理后均显著下调（P＜0.01）,TIMP-1蛋白表达变化差异不显著,MMP-9/TIMP-1之间的比值在钼处理后显著下降（P＜0.01）,表了明钼处理造成MMPs/TIMPs系统严重失衡。此外,采用免疫荧光检测发现,钼处理后IV型胶原蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。这些结果表明了钼处理通过扰乱MMPs/TIMPs系统平衡而破坏围植入期绵羊子宫内膜的微环境。6.钼抑制围植入期绵羊子宫内膜MMPs/TIMPs系统上游通路相关蛋白表达为深入探讨胚胎植入过程中MMPs/TIMPs系统紊乱的分子机制,采用Western-blot检测调控MMPs/TIMPs系统上游通路相关蛋白表达。PI3K/AKT通路相关蛋白表达测定结果表明,在钼处理后PI3K的蛋白表达水平均显著下调（P＜0.01）,AKT蛋白表达在灌喂20 mg/kg钼酸钠后显著下调（P＜0.01）。TGF-β1/Smad2/3通路相关蛋白表达检测结果显示,钼处理后,TGF-β1、Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表达均呈显著下调趋势（P＜0.01）。以上结果表明,钼抑制了PI3K/AKT和TGF-β1/Smad2/3通路的激活。7.钼抑制围植入期绵羊子宫内膜容受性免疫荧光检测围植入期绵羊子宫内膜容受性相关指标蛋白表达发现,在钼处理后HBEGF（P＜0.01）、LIF（P＜0.01）、VEGF（P＜0.01）、ITGβ3（P＜0.01）和MUC1（P＜0.05或P＜0.01）蛋白表达水平均显著下调,表明钼处理降低了围植入期绵羊子宫内膜容受性。综上所述,钼损伤绵羊子宫内膜的形态结构及内膜水平细胞超微结构,促进了内膜细胞凋亡的发生,证实了钼具有明显的雌性生殖毒性;在胚胎植入过程中,钼通过抑制PI3K/AKT和TGF-β1/Smad2/3通路的激活,扰乱子宫内膜MMPs/TIMPs系统的平衡,降低子宫内膜的容受性。本研究以MMPs/TIMPs系统为切入点,阐明了钼调控绵羊胚胎植入的分子机制,为钼雌性生殖毒性机制研究提供理论依据。