杜鹃素是中药材满山红(兴安杜鹃)的主要活性成分,对慢性支气管炎具有明显的治疗作用,还具有抗菌、抗炎和免疫抑制等作用。本课题组前期研究发现,杜鹃素对血管内皮细胞的损伤有保护作用,还可明显抑制血管平滑肌细胞增殖,提示杜鹃素在心血管系统疾病的治疗中将具有重要意义。但杜鹃素是否对自发性高血压大鼠具有降压及对主动脉损伤是否有保护作用等均尚未见报道,因此,本课题研究杜鹃素对大鼠离体主动脉的舒张作用及其对自发性高血压大鼠降压和主动脉损伤保护的影响,并进一步探讨杜鹃素对大鼠主动脉基因表达谱的影响。为杜鹃素在高血压等心脑血管疾病防治中提供理论依据。本论文分为三个部分第一部分杜鹃素对大鼠离体主动脉血管环的舒张作用及其机制研究研究目的:通过离体血管环实验系统,观察杜鹃素对大鼠离体主动脉的肌源性反应;利用激光共聚焦和全细胞膜片钳实验方法 ,初步探讨杜鹃素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞内钙离子浓度和平滑肌细胞L-型电压依赖性钙电流的影响。实验方法:1.大鼠离体主动脉血管环肌源性实验采用血管张力记录仪,用60 m M KCl或1μM PE收缩主动脉,观察杜鹃素对大鼠主动脉的舒张作用,探讨一氧化氮、内皮、细胞外氯化钙的浓度和内质网上相关受体与杜鹃素对大鼠主动脉舒张作用的关系。2.激光共聚焦实验测定大鼠主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度将细胞用荧光染料Fluo-4-AM染色,依次用60 m M KCl,60 m M KCl+14.02μM杜鹃素,正常HEPES液,60 m M KCl灌流细胞,记录各个条件细胞的荧光值。最终用相对荧光密度值来反应细胞内游离钙离子浓度的变化。3.电生理学实验方法 采用全细胞膜片钳技术,记录大鼠主动脉血管平滑肌细胞膜L-型电压依赖性钙电流,并观察杜鹃素作用后的影响。实验结果:1.杜鹃素对KCl或PE预收缩的大鼠主动脉血管环具有浓度依赖性舒张作用。100μM的杜鹃素对KCl或PE预收缩主动脉环的最大舒张百分比分别为66.97%和65.13%,其EC50值分别为14.02μM和35.94μM。该实验表明,杜鹃素对KCl或PE预收缩的血管环舒张作用两者间并没有显著差异。这种舒张血管作用并不受一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)或去内皮的显著影响。去内皮主动脉在无Ca2+溶液中,预孵杜鹃素后,用KCl或PE诱导的基础上,氯化钙量效曲线下移。此外,预孵维拉帕米后,杜鹃素可诱导舒张PE预收缩的去内皮主动脉,并且这种作用可通过Ryanodine受体阻断剂钌红来增强,而IP3受体阻断剂肝素无此作用。2.利用激光共聚焦实验分析原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞内钙离子的变化。14.02μM杜鹃素使细胞内的钙离子荧光密度下降了72.9%,然后血管平滑肌细胞用60 m M KCl(去除杜鹃素)孵浴,KCl又引起细胞内钙离子的增加几乎达到原来的水平,上述结果表明杜鹃素能降低原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞内钙离子的水平。3.膜片钳电生理学实验结果显示,对原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,LVGC最大电流密度为-10.72±0.45 p A/p F。在0 m V出现峰电流,14.02μM杜鹃素抑制LVGC峰电流的百分比为59.50%。表明杜鹃素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞LVGC具有显著的抑制作用。第二部分杜鹃素对自发性高血压大鼠降压作用和主动脉损伤的保护作用及其机制研究研究目的:研究杜鹃素对自发性高血压大鼠的降压作用和主动脉损伤的保护作用,并用不同层次多项实验指标,探讨其作用机制。实验方法:1.WKY和SHR血压、心率和体重的测量8只12周龄的雄性WKY为正常大鼠对照组(WKY+C),24只12周龄的雄性SHR随机分为SHR空白对照组(SHR+C),SHR杜鹃素治疗组(SHR+F)和SHR维拉帕米阳性对照组(SHR+V)。采用灌胃法给药,杜鹃素的给药剂量为:50mg/(kg·d),维拉帕米的给药剂量为:50 mg/(kg·d),对照组给予等量生理盐水,治疗时间为8周。采用尾动脉测压方法每周测定大鼠血压、心率和体重。2.大鼠血浆生化指标的测定按试剂盒说明,用分光光度计或酶标仪,检测四组大鼠血浆中Ang II、ET-1、NO、NOS、SOD、MDA、IL-6和TNF-α含量或活性水平。3.大鼠主动脉匀浆细胞因子的测定按试剂盒说明或文献报道方法,检测四组大鼠主动脉组织匀浆中Nitrite、O2-、e NOS和NAD(P)H oxidase含量或活性水平。4.主动脉组织病理观测取大鼠主动脉,用HE染色和Masson染色,Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量大鼠主动脉相关参数。5.免疫组织化学法或免疫荧光法测定主动脉蛋白的表达大鼠主动脉组织中Collagen I、Collagen III、MMP-2、MMP-9、ROS、NF-k B的表达。6.大鼠主动脉m RNA和蛋白的表达RT-PCR和Western blot法检测各组大鼠主动脉e NOS、p22phox、NF-k B和SM-α-actin m RNA和蛋白的表达。实验结果:1.药物干预前,与同周龄WKY+C组比较,SHR+C组血压明显升高(p<0.01)。用药1周后,SHR+F组血压无显著变化;SHR+V组血压明显降低(p<0.01)。用药2周后,与SHR+C组比较,SHR+F组血压开始缓慢下降,到20周时,血压下降到158±5 mm Hg。药物干预前,SHR+C组大鼠心率比WKY+C组高。实验期间,WKY+C组大鼠心率平稳,基本维持在375 bpm左右;而SHR+C组基本维持在420 bpm左右。SHR+F组大鼠心率和SHR+C组比较无显著性差异。整个实验过程四个实验组大鼠体重都呈现出增长趋势。与SHR+C组比较,SHR+F组体重无显著性差异。2.对Ang II、ET-1、MDA、IL-6和TNF-α在血浆中的含量或活性而言,SHR+C组显著高于WKY+C组(p<0.01)。用杜鹃素灌胃大鼠8周后,与SHR+C组比较,SHR+F组和SHR+V组血浆中Ang II、ET-1、MDA、IL-6和TNF-α的含量都明显降低(p<0.01);相反,对SOD、NO和NOS在血浆中的含量而言,SHR+C组显著低于WKY+C组(p<0.01)。杜鹃素灌胃大鼠8周后,与SHR+C组比较,SHR+F组和SHR+V组血浆中NO的含量明显升高(p<0.01),因此杜鹃素的降压和保护血管损伤作用可能的机制之一是通过降低氧化应激水平、调节免疫因子和舒张收缩血管因子来实现的。3.对e NOS在主动脉组织中的活性而言,SHR+C组显著低于WKY+C组(p<0.01)。杜鹃素灌胃大鼠8周后,与SHR+C组比较,SHR+F组主动脉组织中e NOS的活性明显升高(p<0.01),同样SHR+V组主动脉组织中e NOS的活性也明显升高(p<0.05)。相反,对Nitrite、O2-、NADPH oxidase和NADH oxidase在主动脉组织中的含量或活性水平而言,SHR+C组均显著高于WKY+C组(p<0.05)。用杜鹃素灌胃大鼠8周后,与SHR+C组和SHR+V组比较,SHR+F组主动脉组织中Nitrite、O2-、NADPH oxidase和NADH oxidase的活性明显降低(p<0.05),因此进一步确证杜鹃素保护血管损伤的可能作用机制之一是降低氧化应激水平。4.从HE和Masson染色结果看,SHR+F组和SHR+V组较SHR+C组,大鼠主动脉平滑肌细胞肥大、排列紊乱减轻,内皮细胞排列较整齐,中膜厚度明显减轻,细胞核面积减小,大鼠主动脉的胶原相对含量显著降低(p<0.05)。杜鹃素对自发性高血压大鼠主动脉的损伤有保护作用,具体主要表现在降低主动脉中膜厚度、中膜厚度与内径比、血管壁厚度等。从免疫组化结果看,SHR+F组Collagen I、Collagen III、MMP-2、MMP-9和ROS的表达均显著降低(p<0.01),这可能与杜鹃素对自发性高血压大鼠主动脉损伤的保护作用相关。5.与SHR+C组比较,SHR+F组大鼠主动脉e NOS m RNA和蛋白的表达显著降低(p<0.01),而p22 phox、NF-k B和SM-α-actin m RNA和蛋白的表达显著升高(p<0.01)。第三部分杜鹃素对自发性高血压大鼠主动脉基因表达谱的影响研究目的:研究杜鹃素对自发性高血压大鼠主动脉基因表达谱的影响,寻找最大差异表达基因及与高血压相关的信号通路,为深入研究杜鹃素降血压作用机制提供新思路。实验方法：1.取大鼠主动脉组织,提取总RNA,纯化m RNA,反转录合成双链c DNA。利用PCR线性扩增后,通过PAGE胶电泳纯化,构建好的文库用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System质检合格后,使用Illumina Hi Seq?2000进行测序。2.以WKY+C vs SHR+C作为对照,分析SHR+C vs SHR+F差异表达基因,对差异表达基因进行GO和Pathway分析并进行显著性检验,对差异表达的关键基因进行验证,从基因水平探讨杜鹃素防治高血压和保护主动脉损伤的作用机制。实验结果:1.经过分析,可知WKY+C vs SHR+C的主动脉差异表达的基因数为1991个,其中表达上调444个,表达下调1547个;SHR+C vs SHR+F的主动脉差异表达的基因数为2904个,其中表达上调2329个,表达下调575个;SHR+C vs SHR+V的主动脉差异表达的基因数为1666个,其中表达上调1037个,表达下调629个。2.基于高血压因素,对WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F和SHR+C vs SHR+V的主动脉差异基因GO功能显著性富集分析可知:按GO细胞组分,这些差异基因主要涉及:收缩纤维基因、肌原纤维基因、肌动蛋白细胞骨架基因、肌小节基因、收缩纤维组分基因;按分子功能,这些差异基因主要涉及的分子功能有:结合、蛋白结合、催化活性、结构分子活性、氧化还原酶活性、细胞因子调控的蛋白激酶活性;按参与的生物过程差异基因,主要涉及的生物过程有:细胞过程、代谢过程、细胞代谢过程、肌肉系统过程、生物调控、肌肉收缩、小肌肉代谢过程、基于长丝肌动蛋白、横纹肌收缩、压力效应、生物学过程的调控。3.通过Pathway显著性富集分析,据WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F、SHR+C vs SHR+V三组数据和相关文献报道,我们筛选出三组中7个与高血压相关基因表达的共有信号通路,分别为:血管平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架的调控、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、血管内皮生长因子信号通路、血管紧张素调控的水再吸收通路、肾素血管紧张素系统和钙离子信号系统。4.为了进一步验证WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F、SHR+C vs SHR+V的Vascular smooth muscle contraction信号通路中基因差异表达的准确性,我们选取了在通路中较为关键的10个基因:VOC、ADRA1、AGTR1、Ca M、MLCK、IP3R、PLC、MLC、Ca D和Actin,这些基因的RT-PCR实验结果和二代测序技术的实验结果趋势基本吻合。5.在WKY+C vs SHR+C、SHR+C vs SHR+F和SHR+C vs SHR+V,我们对共表达的453个差异基因进行了聚类分析,同时据四组中基因差异表达倍数为4倍考虑,我们筛选了18个差异极大的基因。其中Adra1d基因不仅与高血压有密切关系,而且在测序数据分析中发现Adra1d基因参与了Pathway显著性富集的信号通路Vascular smooth muscle contraction。Adra1d基因在WKY+C vs SHR+C下调达9.74倍,而SHR+C vs SHR+F上调了7.95倍。结论:1.杜鹃素对大鼠离体主动脉具有显著的舒张作用,其作用机制是抑制L-型电压依赖性钙通道、受体操纵性钙通道和肌浆网上的Ryanodine受体,从而降低了大鼠主动脉血管平滑肌细胞内钙离子的含量。2.杜鹃素显著地降低自发性高血压大鼠的血压且对主动脉的损伤有保护作用,其作用机制可能与调控氧化应激水平、免疫因子和舒张收缩血管因子有关。3.基因表达谱研究初步表明,杜鹃素降低自发性高血压大鼠血压和保护主动脉损伤可能与上调Vascular smooth muscle contraction通路中的Adra1d基因有关。