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目的1.构建热休克蛋白70基因(HSP 70 )重组5型腺病毒载体,为研究HSP 70的基因治疗奠定基础。2.采用“两袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植动物模型,为研究肺移植再灌注损伤提供较为稳定的实验基础。3.利用HSP 70内源性细胞保护的生物学特性,以大鼠同种异体左肺原位移植为动物模型,以人HSP 70为目的基因,复制缺陷的5型重组腺病毒载体为介导,通过离体肺的肺静脉灌注,诱导体内高表达HSP 70,观察其对大鼠移植肺IRI的影响。方法1.利用基因重组技术,构建hHSP70转基因载体,制备、包装腺病毒。2.应用改良的“两袖套一支架管”法,通过对套管的制作、供肺的灌注和获取及套接技术等方面进行改进,单人肉眼直视下完成供受体肺动脉、肺静脉和支气管的吻合。3.以SD大鼠为供受体,改良的“两袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植动物模型,实验分LPDG保存液对照组、空白载体组和hHSP70基因转染组,分别灌注10℃加入肝素的LPD-glucose液、单纯腺病毒载体和hHSP70基因重组腺病毒载体(5×10~9PFU),然后在10℃LPD-glucose液中保存3小时后移入受体,另设假手术对照组。移植肺再灌注后4h,检测以下指标:血气分析;干-湿重比率;移植肺组织中MDA含量、SOD和MPO的活性;病理组织学检查;hHSP70、TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB、Bax、Bcl-2的表达情况;细胞凋亡检测。结果1.成功构建了HSP 70基因重组5型腺病毒载体。2.连续进行大鼠左肺原位移植20例,手术成功率85%,平均总手术操作时间65±10 min,病理组织学检查证实移植肺再灌注后4h成功复制了典型的肺IRI。3.基因转染组再灌注后4h,RT-PCR、免疫组化染色证实移植肺成功表达特异性的hHSP 70基因产物。与对照组比较, PaO2明显上升,W/D降低,差别有显著意义(P<0.05);MDA含量和MPO活性明显下降,SOD活性明显升高(P<0.05);TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB和Bax的表达水平下降(P<0.05);Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。光镜观察转染组肺泡间质水肿减轻,炎症细胞侵润减少,细胞凋亡减少。结论1.成功构建携带hHSP70基因的重组腺病毒载体能在239细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒。病毒颗粒滴度高、纯度好,重组腺病毒感染哺乳动物细胞后能表达目的蛋白,为重组腺病毒应用研究奠定基础。2.应用改良的“两袖套一支架管”法,通过技术改进,成功建立大鼠左肺原位移植动物模型。手术由单人肉眼直视下完成,能基本模拟临床的肺移植过程,适合研究肺的IRI。3.离体供肺经肺静脉灌注转染外源性目的基因切实有效。4.腺病毒载体介导hHSP 70转基因治疗通过抑制TNF-α、IFN-γ和IL-6等炎性细胞因子,减轻过氧化作用,有效地抑制移植肺的IRI。5.HSP 70转基因治疗使bax/bcl-2比值减少,起到抗细胞凋亡的作用。