目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是继肿瘤、心血管疾病之后第三大非传染性的慢性疾病,严重威胁着人类健康。据报道,全球已有3.82亿人患有DM,预计到2035年将达到5.92亿。我国就有近1亿人患有DM,约占全球患病人数的四分之一,患病率位居世界第一位。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是1型和2型DM患者的主要并发症之一,是终末期肾脏疾病导致患者致死致残的主要原因。据统计,大约35%～50%1型、约20%2型DM患者发展成为DN。DN主要病理改变是基底膜增厚,系膜基质增多,细胞外基质增加,最终导致弥漫性或结节性肾小球硬化。目前,其发病的内在机制尚未完全阐明。近年研究确认,氧化应激是公认的DN发生发展的中心环节。其关键酶诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)转基因会引起DN 样病变。iNOS 基因转录最重要的调控因子是核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB),当受到相应刺激时被激活转位入核,调控相关基因转录。P300是细胞内最重要的共激活因子,具有核蛋白乙酰基转移酶活性,参与多种转录因子的调控。研究证实DM时,NF-κB的P65亚基与共激活因子P300结合增多,异常激活基因转录,产生大量iNOS,在DN的发生发展中起关键性作用。C肽是含31个氨基酸的多肽,在胰岛素合成过程中产生,并与胰岛素等摩尔分泌。一直以来,C肽仅作为评价胰岛β细胞功能的指标。近年来,一些研究表明对于实验动物和DM患者,外源性C肽可以防止或逆转DN。一系列研究发现生理浓度的C肽能结合胞膜G蛋白偶联受体,或进入胞质胞核发挥细胞保护效应。本课题前期研究表明高糖(25 mmol/L)刺激下,0.5 nmol/L的C肽定位于大鼠肾小球系膜细胞核,抑制iNOS基因转录及其蛋白的表达,亦能抑制高糖引起的NF-κB核转位。然而C肽是否通过调控NF-κB与P300的相互作用而发挥防治DN的作用,尚未见相关报道。本研究从细胞和动物整体两个方面进行实验。采用大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1进行细胞培养,用激光共聚焦显微镜(Confocal)观察C肽(0.5nmol/L)对高糖(25mmol/L)刺激的细胞中NF-κB的作用及其与P300共定位,用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术检测C肽对NF-κB启动iNOS的调控作用,用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)技术检测C肽对NF-κB与P300相互作用的影响。用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制SD大鼠DM模型,随机分为正常组、病理组、C肽防治组、C肽治疗组和乱码C肽组,实验前后测定血糖、体重变化,测定24h尿白蛋白排泄量。取大鼠肾小球皮质于光镜及透射电镜下进行形态学观察,进一步探讨C肽对防治DN的整体功效及作用。方法:1细胞实验1.1细胞培养大鼠肾小球系膜细胞株(GMCs)HBZY-l,用含10%胎牛血清的低糖DMEM(5.5 mmol/L),0.25%EDTA-胰蛋白酶消化传代,接种于100 ml培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。1.2实验设计与分组(1)Confocal技术观察NF-κB P65核转位及其与P300共定位,同时确定C肽作用的最佳时间。实验分组:1)正常组(Control):GMCs(HBZY-1)用低糖DMEM(5.5mmol/L)正常培养;2)高渗对照组(HO):GMCs用L-葡萄糖 DMEM(25 mmol/L)刺激作用 24 h;3)高糖组(HG):GMCs(HBZY-1)用高糖DMEM(25 mmol/L)刺激作用24 h;4)NF-κB抑制剂(BAY11-7082)加高糖组(IH):正常培养的 GMCs 加入 BAY11-7082(10μM)孵育1 h,换高糖DMEM(25 mmol/L)刺激作用24 h;5)C肽治疗组(CP):GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后,换成0.5 nmol/L C肽-高糖DMEM 分别培养 10、20、30、40、50、60 min。(2)ChIP技术检测C肽对NF-κB启动iNOS的调控作用。实验分组:1)正常组(Control):GMCs 用低糖 DMEM(5.5 mmol/L)正常培养;2)高糖组(HG):GMCs用高糖DMEM(25mmol/L)刺激作用24h;3)C肽治疗组(CP):GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后,换成0.5 nmol/L C肽-高糖DMEM培养30 min。(3)Co-IP技术检测C肽对NF-κB与P300结合作用的影响。实验分组:1)正常组(Control):GMCs 用低糖 DMEM(5.5mmol/L)正常培养;2)高糖组(HG):GMCs用高糖DMEM(25mmol/L)刺激作用24h;3)C肽治疗组(CP):GMCs用高糖DMEM刺激作用24 h后,换成0.5 nmol/L C肽-高糖DMEM培养30 min。2动物实验2.1实验设计与分组健康雄性SD大鼠80只,随机分为2组,正常对照组(NC,8只),其余72只注射STZ溶液(STZ溶于浓度为0.1 mol/L的柠檬酸纳缓冲液,pH 4.4,新鲜配制,终浓度为10mg/mL,按45mg/kg腹腔注射)制备DM模型。注射3天后,尾静脉采血测血糖值≥16.7mmol/L,尿糖+++以上,为造模成功。造模成功68只,再随机分成4组:病理组(DM,17只),C肽防治组(DM+CP-P,17只),C肽治疗组(DM+CP-T,17只),乱码C肽治疗组(DM+scCP,17只),以上五组均于20～25℃室温下正常饮食喂养。DM+CP-P组在造模成功后,开始皮下注射人C肽(130 nmol/kg),每天2次,治疗6周后停药。DM+CP-T组和DM+scCP组在病程6周后,分别开始同剂量皮下注射人C肽或乱码C肽,每天2次,治疗6周。最后股动脉放血处死。2.2检测血糖和24 h尿液取尾静脉血,用血糖仪检测并记录注射STZ前、后第3天和第12周的血糖变化。收集24h尿液,检测尿蛋白排泄量。2.3形态学观察取大鼠肾小球皮质作病理切片,分别于光镜和透射电镜下观察。结果:1不同时间点,C肽对CP组GMCs NF-κB P65核转位及其与P300共定位的影响Confocal结果显示,高糖刺激GMCs 24 h,会引起NF-κB P65转位入核,且NF-κB P65与P300共定位于细胞核;0.5 nmol/L C肽治疗在30 min时效果显著,即NF-κB P65聚集于胞质,P300聚集于胞核;40～60 minC肽作用逐渐减弱至基本消失。因此选30 min作为C肽治疗高糖长时间刺激细胞最佳的作用时间。2 ChIP技术检测C肽治疗30 min时,对CP组GMCs NF-κB启动iNOS的调控作用高糖刺激GMCs 24 h后,细胞内NF-κB在iNOS启动子区近端的结合作用(4.44 ± 0.29,P<0.05)与Control组相比明显升高;0.5 nmol/L C肽治疗30 min后,细胞内NF-κB在iNOS启动子区的近端结合作用(1.86 ±0.21,P<0.01)与HG组相比显著下降。高糖刺激GMCs 24 h后,细胞内NF-κB在iNOS启动子区远端的结合作用(5.06 ±0.43,P<0.05)与 Control 组相比明显升高;0.5 nmol/L C肽治疗30 min后,细胞内NF-κB在iNOS启动子区的近端结合作用(0.94 ±0.07,P<0.05)与HG组相比明显下降。3 Co-IP技术检测C肽治疗30 min时,Control组、HG组和CP组GMCs NF-κB P65与P300的结合作用Control组、HG组和CP组细胞蛋白裂解液分别加入P300抗体沉淀处理后,Western blot结果显示:HG组GMCs P65与P300蛋白结合量(18.31 ±0.82,P<0.05)比 Control 组(5.99 ± 0.07)明显升高;CP 组 GMCs P65与P300蛋白结合量(5.220±0.33,P<0.01)比HG组显著下降。Control组、HG组和CP组细胞蛋白裂解液分别加入P65抗体沉淀处理后,Western blot结果显示:HG组GMCs P300与P65蛋白结合量(9.19±0.17,P<0.01)比 Control 组(3.54±0.21)显著升高;CP 组 GMCsP300与P65蛋白结合量(2.98 ±0.23,P<0.01)比HG组显著下降。4大鼠的一般表现,C肽对DM大鼠血糖、体重和尿白蛋白排泄量的影响造模成功的大鼠逐渐出现消瘦,皮毛疏松无光泽,反应迟钝,多饮、多尿、多食,生长发育迟缓等症状。随着实验进行,DM组和DM+scCP组病症更加明显,而DM+CP-P组和DM+CP-T组病症与NC组相似。各组大鼠入选时血糖和体重无显著性差异。整个实验中,DM+CP-P组平均血糖(29.96 ± 0.52)mmol/L,DM+CP-T 组(28.90 ± 0.74)mmol/L,DM+scCP 组(29.74 ± 0.66)mmol/L,均与 DM 组(29.23 ± 0.66)mmol/L无显著性差异。以上四组均显著高于NC组(6.40 ± 0.25)mmol/L(P<0.01)。C肽治疗结束时,DM+CP-T组平均体重(271.82 ±8.76)g,DM+scCP组(248.35 ±7.19)g,均与DM组(249.0 ±7.13)g无显著性差异。以上四组均显著低于NC组(515.5 ± 14.42)g(P<0.01)。C肽治疗结束时,DM组24小时尿蛋白排泄量(327.93±32.58)mg和DM+scCP 组(293.79 ±49.40)mg 均明显高于 NC 组(15.42 ± 4.06)mg(P<0.05);DM+CP-P 组(55.21 ± 4.06)mg 和 DM+CP-T组(70.2 ± 9.46)mg明显低于DM组(P<0.05)。5肾小球形态学观察肾小球光镜(× 400)下观察:NC组肾小球未见异常;DM组可见到肾小球结构异常、肾小囊腔增大;DM+scCP组与DM组相似,并且有肾小球坏死的现象;而DM+CP-P组和DM+CP-T组,可见肾小囊腔缩小,与病理组相比有所改善,且DM+CP-P组比DM+CP-T组的病变较轻。肾小球透射电镜(×20K)下观察:NC组肾小球未见异常。DM组可见基底膜重度增厚,局部呈丘状隆起,血管内皮细胞重度增生,部分足细胞足突融合;DM+scCP组与DM组相似,基底膜明显增厚;DM+CP-P组和DM+CP-T组可见基底膜和血管内皮细胞接近正常,足细胞足突部分轻度融合,比DM组有明显改善,且DM+CP-P组较DM+CP-T组的病理改变减轻。结论:1 C肽调控NF-κB与P300防治糖尿病肾病的机制是:(1)C肽能抑制NF-κB P65的核转位及其与P300的共定位。(2)C肽能抑制高糖引起的NF-κB核转位与iNOS启动子区远、近端均有相互作用,从而抑制NF-κB启动iNOS基因。(3)C肽能抑制高糖引起的NF-κB与P300之间的相互作用。2光镜和透射电镜下观察到,C肽能明显改善DM大鼠肾小球的功能和形态学变化。