背景:结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染导致的结核病（Tuberculosis,TB）是威胁全球公共健康的传染性疾病,也是单一转染病中死亡率高于艾滋病的传染病。据WHO报道,在2019年,全球大约有1000万人患有结核病,而其中中国、印度、南非等30个国家被归为结核病高负担国家,占全球结核病发病的87%。尽管目前结核病的治疗周期及疗效已极大提高,但耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）及TB/HIV共感染的治疗仍然很棘手。结核分枝杆菌感染后,被肺部的巨噬细胞及树突状细胞吞噬,适应性免疫应答被激活,最后形成肉芽肿组织。近年发现,一些Mtb的细胞壁蛋白和分泌蛋白存在O-甘露糖基化修饰,并且这种修饰与蛋白质的Sec转位途径密切相关。在蛋白质的O-甘露糖基化功能研究中,蛋白质的O-甘露糖基化修饰不仅可以影响蛋白质的水解及定位,也参与致病菌与宿主相互作用。结核分枝杆菌中的蛋白质O-甘露糖基化过程的起始反应由蛋白质O-甘露糖基转移酶（PMT）所催化。PMT可以催化第一个甘露糖基连接到蛋白质多肽链的Ser或Thr残基上,再经甘露糖基转移酶（MT）或其他糖基转移酶延长糖链。结核分枝杆菌中的PMT由Rv1002c编码,其在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Msm）中的同源基因是MSMEG＿5447,二者是分枝杆菌中蛋白质O-甘露糖基化过程的关键酶。以往研究主要是针对特定蛋白质的O-甘露糖基化修饰作用,而分枝杆菌整体的糖基化修饰对分枝杆菌的生物学特性的影响及在感染中的生物学作用的研究很少。此外,我们的前期研究发现,Mtb的细胞壁蛋白Rv1096是O-甘露糖基化蛋白,该蛋白具有肽聚糖脱乙酰基酶活性,通过催化结核分枝杆菌肽聚糖脱去乙酰基抵抗宿主溶菌酶杀伤。但Rv1096的蛋白质O-甘露糖基化在分枝杆菌感染宿主中的影响尚不清楚。因此,本课题以Msm为模式菌,探讨PMT控制的蛋白质O-甘露糖基化对分枝杆菌生物学特性的影响及在感染中的生物学作用,并初步探讨了PMT的靶蛋白Rv1096的O-甘露糖基化的生物学作用。本研究结果将有助于我们整体深入理解O-糖基化蛋白的生物学作用,为研发更有效的预防结核病的疫苗及新的抗结核药物提供理论依据。方法:1.MSMEG＿5447基因缺失对Msm生物学特性的影响本实验室前期已构建了蛋白质O-甘露糖基转移酶MSMEG＿5447基因敲除菌株（（35）M5447）。为了更全面地揭示MSMEG＿5447的功能,本研究中,我们首先构建了MSMEG＿5447基因补偿菌株Comp。我们利用酶标仪测定MSMEG＿5447基因缺失对Msm生长速率的影响;利用显微镜观察了Msm菌落的形态;利用超速离心分离Msm的亚细胞组分,进而用Con A凝集素印迹检测细菌的蛋白质O-甘露糖基化水平;利用刃天青显色法观察溶菌酶对Msm的影响;利用酸性培养基培养Msm各菌株,测定Msm对酸性环境的耐受力;利用Msm对溴化乙锭的吸收速率测定Msm的细胞壁渗透性;分别用M63培养基和LB培养基培养Msm以观察其生物膜的形成;制备糖脂并用PAS染色检测Msm中含甘露糖结构的糖脂LAM（聚阿拉伯糖甘露糖脂）及其合成前体LM（聚甘露糖脂）的合成情况;利用双向电泳联合质谱分析鉴定Msm蛋白质组的变化。2.MSMEG＿5447基因缺失对Msm感染巨噬细胞的影响及机制研究以巨噬细胞感染实验为基础,利用平板计数菌落形成（CFU）及荧光染料法观察Msm对巨噬细胞中的入侵能力及在巨噬细胞的存活力;利用q PCR和ELISA法检测巨噬细胞的细胞因子水平;利用q PCR、Western blot、免疫荧光法检测转录因子NF-κB的激活;利用荧光标记的Lyso Tracker Red及LAMP1检测Msm与巨噬细胞溶酶体的融合情况;利用Western blot检测溶酶体相关水解酶CTSD的表达水平。利用RNA测序技术检测感染Wt与△M5447菌株的THP-1细胞的转录组,进而分析MSMEG＿5447基因缺失对Msm感染巨噬细胞的影响;3.结核分枝杆菌Rv1096蛋白的O-甘露糖基化在感染中的作用研究以过表达Rv1096蛋白的Msm菌株MS＿Rv1096和过表达糖基化位点（T265,S266,S267）发生突变的蛋白Rv1096am的Msm菌株MS＿Rv1096am为基础,利用Con A凝集素印迹检测Rv1096的O-甘露糖基化修饰;利用Con A凝集素法检测突变蛋白Rv1096am的O-甘露糖基化水平;利用超速离心法制备MS＿Rv1096亚细胞组分并检测Rv1096的亚细胞定位;利用胰蛋白酶法检测Rv1096及Rv1096am在Msm中细胞表面的定位;利用平板计数法及罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞检测被感染巨噬细胞中MS＿Rv1096及MS＿Rv1096am的存活力;利用荧光标记的Lyso Tracker Red检测巨噬细胞中含Msm的吞噬体与溶酶体的共定位情况。结果:1.MSMEG＿5447基因缺失影响Msm的生物学特性在本部分研究中,我们首先成功构建蛋白质O-甘露糖基转移酶MSMEG＿5447补偿菌株Comp;发现MSMEG＿5447基因缺失使得Msm在7H9液体培养基中的生长受损,在7H11固体培养基上的生长菌落变小且结构不规则,但在LBT液体培养基中的生长正常,因此,在后续实验中,将在LBT培养基中培养Msm相关菌株;Con A凝集素印迹分析,发现MSMEG-5447基因缺失降低Msm中全细胞裂解物（WCL）、细胞壁（CW）及细胞膜（CM）中的蛋白质O-甘露糖化水平;在分析MSMEG-5447基因对Msm抵抗外界压力影响时,发现MSMEG＿5447基因缺失降低Msm对溶菌酶及酸性环境的抵抗,增加了Msm细胞壁的渗透性,减少了Msm生物膜的形成;此外,蛋白质O-甘露糖基化的缺失促进Msm中糖脂LAM的合成;最后,Msm蛋白质组学分析发现MSMEG＿5447基因缺失影响鸟氨酸转氨酶、磷酸甘油醛脱氢酶及磷酸甘油醛异构酶等6个蛋白的表达,这些差异蛋白主要参与Msm糖酵解、果糖甘露糖代谢及氧化还原过程。2.MSMEG＿5447基因缺失影响Msm在巨噬细胞中的存活在本部分研究中,我们首先建立了Msm感染THP-1细胞的模型,利用细胞内菌落计数分析Wt、△M5447及Comp菌株在感染细胞后0 h及24 h的存活情况,发现△M5447菌株入侵巨噬细胞的数量并没有显著变化,但△M5447在巨噬细胞的存活数量显著下降,荧光染料法检测法也显示,在感染后24 h,△M5447-GFP在巨噬细胞内的荧光强度显著下降;q PCR及ELISA结果显示,△M5447菌株感染的巨噬细胞中TNF-α及IL-6的表达显著下降,NF-κB p65亚基的磷酸化水平下降,说明蛋白质O-甘露糖基化的缺失减弱Msm感染宿主细胞的炎症反应;我们还发现,△M5447菌株与巨噬细胞溶酶体融合增加,细胞中溶酶体相关水解酶CTSD蛋白的表达增加,提示抑制吞噬体-溶酶体融合可能是蛋白质O-甘露糖基修饰发挥功能的潜在分子机制。最后,转录组测序结果显示,与Wt相比,△M5447菌株感染的巨噬细胞的差异表达基因显著富集在炎症信号相关通路;3.结核分枝杆菌Rv1096的O-甘露糖基化修饰在感染中发挥作用在本部分研究中,我们以Mtb的细胞壁糖蛋白Rv1096为研究对象,探究Rv1096O-甘露糖基化对该蛋白功能的影响,通过Con A凝集素印迹,发现Rv1096蛋白的O-甘露糖基化位点有三个,分别是T265、S266和S267,且只突变T265位点O-甘露糖基化水平下降明显,确定了过表达O-甘露糖基化修饰缺失的Rv1096重组Msm（MS＿Rv1096am）;进一步实验发现,Rv1096蛋白的O-甘露糖基化缺失并不影响Msm的生长速率,且不影响Rv1096蛋白在细胞壁中的定位;细胞内菌落计数及荧光检测结果发现,与MS＿Rv1096相比,MS＿Rv1096am菌株在RAW264.7细胞内存活力下降;Lysotracker Red染色结果发现,缺失O-甘露糖基化后,MS＿Rv1096am感染的巨噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合增加。结论:1.MSMEG＿5447基因缺失影响了Msm的生长及生物膜的形成,减弱了Msm对溶菌酶及酸性环境的耐受力,增加了细胞壁的渗透性,并影响了其糖代谢相关蛋白的表达。2.MSMEG＿5447基因缺失降低Msm在巨噬细胞的存活,减弱了Msm感染细胞的炎症反应,促进了吞噬体-溶酶体融合。3.Rv1096蛋白的O-甘露糖基化抑制了吞噬体-溶酶体融合,进而促进了MS＿Rv1096菌株在巨噬细胞内存活。