重组pGH原核表达产物纯化及其生物活性研究

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本研究首先将克隆到的猪生长激素(pGH)基因cDNA编码区片段定向插入pGEX1-λT载体,转化大肠杆菌TOP10F’,用菌落PCR和质粒PCR方法筛选阳性克隆;以BamHI和EcoRI酶切鉴定重组质粒。以IPTG诱导融合蛋白表达,产物经SDS-PAGE分析。得到高效表达猪GH的重组质粒pGEX1-λT-pGH,SDS-PAGE分析证明诱导重组质粒菌株表达了融合蛋白,分子量约为50KDa,与预期的26KDa的GST带和24.4KDa的猪生长激素基因编码蛋白质构成的融合蛋白大小一致。 从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收正确表达的融合蛋白,以此免疫新西兰白兔,制备得到滴度为1:6400的兔抗pGH高免血清。在此基础上,完成了对抗体的纯化和鉴定。采用辛酸—硫酸铵法对制得的多克隆抗体进行纯化,用紫外分光光度计检测纯化抗体蛋白含量,SDS-PAGE检测抗体纯度,用蛋白质印迹分析和免疫组化分析检查了纯化后抗体的免疫活性。结果显示:经辛酸—硫酸铵纯化抗体纯度达到PAGE纯,含量为19.2mg/ml;纯化后的pGH多抗与从猪垂体提取的天然pGH蛋白分子(24KDa)和表达融合蛋白(50KDa)均有特异性结合能力。纯化后的pGH多抗以1:150的滴度检测到猪垂体前叶细胞的细胞质有pGH免疫阳性信号。在上述基础上进行了表达包涵体的变性复性研究和重组pGH的生物活性研究。菌体用裂解缓冲液(Tris-HCl 50mmol/L,EDTA 0.5mmol/L,NaCl 50mmol;PH7.9)悬浮,加入20%脱氧胆酸钠(DOC)水溶液至终浓度2%,用超声波将细胞破碎完全,低温离心收集沉淀。用裂解缓冲液(添加尿素或盐酸胍至2mol/L)重新悬浮、洗涤沉淀两次。比较包涵体在6mol/L盐酸胍(pH8.0)和8mol/L尿素(PH8.0)中的溶解情况。溶解
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