氧化葡萄糖酸杆菌多酶组装合成赤藓糖

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赤藓糖是一种稀有的丁醛糖,在自然界中数量稀少。传统化学工业生产赤藓糖成本较高且纯度不高。随着生物技术的发展可通过生物催化合成赤藓糖,利用微生物催化原料廉价的赤藓糖醇,两步合成赤藓糖。该方法相较于化学合成成本较低,产率和纯度都有一定的提高。但两步合成有一定局限性,即在催化过程不易控制,操作麻烦。本课题以氧化葡萄糖酸杆菌为宿主细胞,利用多酶自组装的方法将两个参与赤藓糖生物合成的级联酶—异源的核糖异构酶(L-RI)与该菌细胞膜上自有的山梨醇脱氢酶(SDH)通过自组装实现共定位,期望能够构建赤藓糖一步发酵的重组菌,提高赤藓糖在氧化葡萄糖酸杆菌中的产率,并对催化条件进行优化,进一步提高其产量。  在氧化葡萄糖酸杆菌中,利用不同的表达方法将L-RI定位到SDH上,实现胞内酶定位到膜上。结果显示两种酶在不同linker融合下无法表达,在相互作用蛋白对的介导下则能够发生自组装。在相互作用蛋白对介导下两种酶形成底物通道,减少中间产物的扩散,相较于共表达菌最高能够提高1.5倍的赤藓糖产量。  选择绿色荧光蛋白定位组装山梨醇脱氢酶来验证氧化葡萄糖酸杆菌中的蛋白组装效果,比较对照菌PTG和GFP组装菌株PPGS的膜组分的荧光强度,仅在PPGS的膜组分中检测到绿色荧光,证明了在氧化葡萄糖酸杆菌中SDH与L-RI在相互蛋白对的介导下能够实现自组装。  针对L-RI组装菌,对反应过程中的pH、温度、底物浓度、菌体浓度等条件进行优化。当催化条件为50g/L静息细胞在pH7.0的PBS中,30℃C下催化100g/L的赤藓糖醇能够生成23.5g/L的赤藓糖,相较于传统两步法催化提高了38.2%的产率。
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