研究目的MN-08是美金刚（memantine）的硝酸酯衍生物,它在结构上集合了美金刚母核和硝酸酯基团;在生物效应上它集合了拮抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体以及释放NO的功能。最新研究表明NMDA受体是治疗动肺动脉高压（Pulmonary hypertension,PH）的新靶点,而且NO是治疗肺动脉高压的经典分子。本课题将MN-08用于PH的治疗,研究MN-08在野百合碱诱导的慢性PH大鼠模型和U46619联合L-NG-Nitroarginine Methyl Ester（L-NAME）诱导的急性大鼠PH模型中疗效评价;研究MN-08对离体肺动脉环的舒张效能及其作用机制;探讨MN-08抑制肺动脉增殖重构与纤维化的作用机制。为候选化合物MN-08开发治疗PH新药提供实验数据支持。研究方法1.通过计算机模拟和膜片钳技术研究MN-08与NMDA受体的结合能力;使用q PCR技术,进一步证明NMDA受体在肺动脉中的表达;使用药代动力学方法和技术,研究MN-08在肺组织中的聚集和靶向性。2.单次皮下注射野百合碱（monocrotaline,MCT）建立SD大鼠PH模型。在这模型中对比memantine、MN-08以及阳性药sildenafil的疗效;研究MN-08不同给药途径、不同治疗时间的药效学作用。以大鼠右心室压,右心重构指数、右心比体重指数和肺组织病理为主要评价指标。3.建立U46619联合L-NAME诱导的急性PH大鼠模型。在此模型中以右心室压化为主要指标,研究MN-08在急性PH模型静脉连续给药的药效作用。4.应用离体肺动脉血管环,通过加入不同阻断剂,研究MN-08舒张肺动脉的作用机制。5.使用血小板生长因子（h PDGF-BB）建立肺动脉平滑肌增殖模型,使用MTT和Edu检测MN-08对肺动脉平滑肌增殖的抑制作用。6.利用H&E染色、Masson染色、免疫组化、Western blot等技术,探讨MN-08抑制肺动脉增殖重构与纤维化可能的作用机理。研究结果1.通过qPCR技术,发现在大鼠肺动脉中,NMDA受体表达丰富。分子对接模拟数据显示MN-08能与NMDA受体结合的位点在NMDA受体的离子通道上,且这一位点与memantine和NMDA受体共结晶位点重叠;MN-08与NMDA受体结合势能强于memantine。膜片钳实验结果显示MN-08与memantine的EC50值分别为14.3mM和3.3mM,虽然MN-08的EC50值是memantine的4.3倍。组织分布研究结果表明,MN-08在肺组织中的暴露量高达29%。2.在MCT诱导大鼠慢性PH模型中,对比评价了MN-08、memantine和sildenafil的疗效;探索了MN-08最佳给药途径;对比了不同治疗时间对疗效的作用。实验结果显示:（1）对比评价MN-08（12.5 mg/kg,i.v.,b.i.d.）、memantine（10 mg/kg,i.v.,b.i.d.）和sildenafil（10 mg/kg,i.v.,b.i.d.）的疗效的研究。MCT诱导大鼠形成PH模型,21天后右心室压（ctrl组:32.9±6.6 mm Hg,model组:105.2±23.5 mm Hg）和右心重构指标RV/LV+S（ctrl组:0.29±0.02,model组:0.73±0.07）显著上升（p<0.001）。在右心室压指标中,MN-08组（70.9 mm Hg）与模型组（105.2 mm Hg）相比,能够明显降低右心室压（p<0.05）。memantine（82.7 mm Hg）和sildenafil（81.7 mm Hg）均能改善大鼠肺动脉高压症状,但是无统计学差异。在右心重构指标（RV/LV+S）中,MN-08组（0.54±0.11,p<0.01）和sildenafil组（0.58±0.11,p<0.05）能够明显改善右心重构,但是memantine（0.62±0.10）无统计学差异。（2）不同给药途径对MN-08疗效的影响。实验分为正常组、模型组、口服MN-08组低（7.5 mg/kg,i.g.,b.i.d.）、中（15 mg/kg,i.g.,b.i.d.）和高（30 mg/kg,i.g.,b.i.d.）以及静脉注射MN-08组（12.5 mg/kg）。MCT诱导大鼠形成PH模型,21天后右心室压（ctrl组:26.0±3.8 mm Hg,model组:89.6±28.7 mm Hg）和右心重构指标RV/LV+S（ctrl组:0.30±0.02,model组:0.44±0.07）显著上升（p<0.001）。在右心室压指标中,口服MN-08组低中高三个剂量组分别为85.8±20.6 mm Hg、79.6±20.6 mm Hg和67.0±15.8 mm Hg;静脉注射MN-08组为52.1±13.9 mm Hg。其中静脉注射组（p<0.001）和口服组高剂量组（p<0.05）均能显著降低大鼠右心室压。在右心重构指标（RV/LV+S）中,口服MN-08组低中高三个剂量组分别为0.47±0.08 mm Hg、0.46±0.09 mm Hg和0.37±0.09 mm Hg;静脉注射MN-08组为0.35±0.04 mm Hg。其中静脉注射组（p<0.01）和口服组高剂量组（p<0.05）均能显著降低大鼠右心室压。（3）不同治疗时间对MN-08疗效的影响。大鼠通过皮下注射MCT诱导21天形成肺动脉高压。MN-08治疗周期为一周、两周和三周。在治疗周期为一周实验中,MN-08无改善大鼠肺动脉高压症状。在治疗周期为两周实验中,实验分为正常组、模型组、静脉注射MN-08组低（3 mg/kg,i.v.,b.i.d.）、中（6 mg/kg,i.v.,b.i.d.）和高（12 mg/kg,i.v.,b.i.d.）以及阳性药sildenafil组（10 mg/kg,i.v.,b.i.d.）。在右心室压指标中,MN-08组低中高三个剂量组分别为62.4±12.6 mm Hg、50.7±15.9 mm Hg和43.5±14.3 mm Hg,sildenafil组为51.5±14.3 mm Hg。其中MN-08高剂量组（p<0.05）能显著降低大鼠右心室压,sildenafil组能降低这一指标但无统计学差异。在右心重构指标（RV/LV+S）中,MN-08组低中高三个剂量组分别为0.42±0.04 mm Hg、0.41±0.08 mm Hg和0.37±0.06mm Hg;sildenafil组为0.40±0.04 mm Hg。其中MN-08高剂量组（p<0.05）能显著改善大鼠右心重构,sildenafil组能降低这一指标但无统计学差异。在治疗周期为三周实验中,实验分为正常组、模型组、静脉注射MN-08组低（6 mg/kg,i.v.,b.i.d.）、中（12 mg/kg,i.v.,b.i.d.）和高（18 mg/kg,i.v.,b.i.d.）以及阳性药sildenafil组（10 mg/kg,i.v.,b.i.d.）。21天后评价大鼠右心室压,MN-08组低中高三个剂量组分别为81.6±16.6 mm Hg、76.4±13.5 mm Hg和72.6±18.0 mm Hg,sildenafil组为82.2±22.4 mm Hg。其中MN-08中（p<0.05）和高（p<0.01）剂量组能显著降低大鼠右心室压,sildenafil组能降低这一指标但无统计学差异。在右心重构指标（RV/LV+S）中,MN-08组低中高三个剂量组分别为0.49±0.08 mm Hg、0.44±0.06 mm Hg和0.42±0.07 mm Hg,sildenafil组为0.46±0.07mm Hg。其中MN-08中和高剂量组（p<0.001）和sildenafil组（p<0.05）均能显著改善大鼠右心重构。3.使用U46619联合L-NAME诱导SD大鼠,建立长时间稳定（大鼠右心室压在35-40 mm Hg之间波动）的急性PH大鼠模型。实验分为模型组、MN-08低中高（6,12,18 mg/kg）剂量组和sildenafil组。模型诱导形成后,通过连续静脉注射MN-08和sildenafil,20分钟内注射完。结果显示MN-08的三个剂量组均能有效降低大鼠右心室压,MN-08高剂量组降低右心室压作用略低于Sildenafil（10 mg/kg）。4.在离体肺动脉血管环实验中,MN-08(EC50:16.7mM)舒张肺动脉的效能与sildenafil(EC50:22.7mM)相当;加入一氧化氮合酶抑制剂（ODQ）,MN-08舒张肺动脉的能力下降;MN-08浓度为10mM（p<0.05）和30mM（p<0.001）可以明显抑制钙离子内流。5.在细胞增殖实验和划痕实验中,h PDGF-BB（10 ng/ml）能够诱导肺动脉平滑肌细胞明显增殖。加药组分为MN-08低中高（1、3、10mM）三个剂量组以及阳性药memantine组。MN-08中（p<0.05）、高（p<0.01）剂量组和memantine（p<0.05）组均能明显抑制肺动脉平滑肌增殖与迁移。6.H&E染色结果显示,MCT诱导大鼠肺动脉高压21天,肺动脉壁明显增厚。MN-08低中高（6,12,18 mg/kg,i.v.,b.i.d.）三个剂量组和sildenafil组均能部分抑制肺动脉增厚。MASSON染色结果表明,模型组大鼠肺纤维化程度明显升高,MN-08和sildenafil能够抑制肺动脉的纤维化,其中MN-08低剂量和高剂量组具有明显的统计学差异。7.MN-08可以通过下调TGF-β1的表达,从而下调Smad3磷酸化,抑制TGF-β/Smad信号通路。MN-08还可以下调PCNA和α-SMA的表达。研究结论1.NMDA受体不仅在神经系统中大量表达,而且在肺动脉中表达丰富,抑制NMDA受体的过度激活是治疗肺动脉高压的有效途径。MN-08能够与NMDA受体有效结合,抑制NMDA受体的过度激活。MN-08能高浓度聚集于大鼠肺组织中,这种高浓度聚集的现象可能与肺动脉丰富的NMDA受体有关以及高血流灌注量有关。MN-08还具有缓慢释放NO,舒张动脉的能力。MN-08是双功能化合物,它既可以拮抗NMDA受体,还可以释放NO,因此我们将MN-08用于PH的治疗。2.MN-08在MCT诱导大鼠慢性PH模型中,疗效强于memantine和sildenafil。MN-08不同给药途径,疗效具有差异,尾静脉注射给药优于口服给药。在不同的治疗时长（治疗一周,两周和三周）,MN-08均能显示对PH的治疗效果,治疗三周的疗效强于两周。在急性PH模型中,MN-08也能显著的降低大鼠右心室改善PH症状。3.MN-08具有舒张肺动脉的作用,且效能与阳性药sildenafil相当。MN-08可以通过自身释放NO激活NO/c GMP信号通路以及抑制细胞外钙内流达到舒张肺动脉的作用。4.MN-08可以肺动脉的增殖以及肺组织纤维化,从而改善肺动脉高压症状。5.MN-08可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,降低TGF-β1的表达,抑制TGF-β/Smad信号通路,同时还能下调PCNA以及α-SMA的表达,从而降低肺动脉重构和纤维化改善PH症状。本课题在细胞水平、离体组织水平和动物水平阐明了化合物MN-08对大鼠PH模型的治疗作用,完成了临床前药效学研究,为临床研究提供可靠的数据支持。