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背景： 骨性关节炎(osteoarthritis OA)是与年龄相关的最常见的关节性疾病。有研究发现OA的发生与线粒体单倍型相关，所谓线粒体单倍型本质上指代线粒体DNA(mtDNA)多态性，指含有某一多态模式的一个集合。有文献报道欧洲人群中单倍型J能够降低OA的发生风险，且不易恶化，而单倍型U能够提高OA的发生风险，且易恶化。而课题组在前期研究中发现单倍型G是OA发生的风险因子，单倍型B4是OA发生的保护性因子，通过构建仅线粒体DNA不同而核背景完全相同的细胞模型来探讨线粒体遗传背景下骨性关节炎的发生机制。 目的： 1、根据前期的实验结果，筛选特定单倍型B4，G两个单倍型的个体，抽取外周血，提取血小板，用来构建相应的细胞模型。 2、检测B4，G两种单倍型细胞模型的线粒体功能差异性，揭示线粒体遗传学背景对骨性关节炎发生发展机制影响。 3、由于软骨细胞处于低氧环境，主要能量来源是糖酵解，检测两种单倍型细胞模型的糖酵解水平，探讨线粒体单倍型在能量代谢中所起到的作用。 4、探讨B4，G单倍型在骨性关节炎发生发展中的作用及其临床应用价值。 方法： 1、根据前期实验结果发现，线粒体单倍型B4是骨性关节炎发生的保护性因子，而单倍型G是其发生的风险因子，收集同一地区、健康人的外周血，提取全基因组DNA，筛选特定的B4，G两个单倍型个体。 2、抽取B4，G两单倍型个体的外周血，分离血小板，与不含线粒体DNA(mtDNA)的143B rho0细胞融合，构建只有线粒体不同而核背景完全相同的细胞模型。 3、PCR扩增mtDNA:收集B4，G两单倍型的细胞，提取DNA，设计24对重叠连续引物， PCR扩增mtDNA全序， PCR产物直接测序。 4、将B4，G两单倍型细胞模型培养至最佳状态后，检测两单倍型细胞模型的线粒体功能，分析B4，G两单倍型细胞模型的线粒体功能差异性。 1)应用多功能酶标仪检测两单倍型细胞模型的复合体酶活性。 2)应用ATP检测试剂盒分析两单倍型产生ATP的差异性。 3)应用ROS检测试剂盒检测两单倍型细胞模型ROS产生的差异性。 4)应用非变性胶技术检测到G单倍型细胞模型的线粒体复合体Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ的超级复合体含量高于B4单倍型. 5、应用乳酸检测试剂盒，检测两单倍型细胞模型乳酸产生量的差异性。 6、细胞活性分析:应用CCK-8.检测液对B4，G两单倍型细胞模型的细胞活性进行分析。 7、应用NAD+/NADH ratio检测试剂盒检测B4，G两单倍型细胞模型的NAD+/NADH ratio。 8、统计学分析:应用SPSS16.0软件分析我们所构建的B4，G两单倍型的细胞模型之间的线粒体功能差异性，以期发现线粒体单倍型在骨性关节炎发生发展中的作用。 结果： 1、对B4，G两单倍型的细胞模型进行复合体酶活性分析，结果显示G单倍型的细胞模型的复合体Ⅰ及复合体Ⅲ的活性显著高于B4单倍型的细胞模型，P值均小于0.001。 2、常氧情况下，对B4，G两单倍型的细胞模型进行ATP产能检测，结果显示G单倍型的细胞模型ATP产生量低于B4单倍型的细胞模型，但无显著性差异，加入线粒体复合体Ⅰ抑制剂Rotenone及复合体Ⅲ抑制剂Antimycin A后，可认为抑制了氧化磷酸化产能，此时的ATP全部来源于糖酵解，两单倍型的ATP产生量均有显著性降低，P值均小于0.001;加入Rotenone后，G单倍型的细胞模型由糖酵解产生ATP的量仍然低于B4单倍型，P＜0.01，加入AntimycinA后，G单倍型的细胞模型糖酵解产生ATP的量也仍然低于B4单倍型，P＜0.001。 3、G单倍型的细胞模型的线粒体DNA拷贝数低于B4单倍型，P＜0.05。 4、低氧情况下，对B4，G两单倍型的细胞模型进行ATP产能检测，G单倍型的细胞模型ATP产生量低于B4单倍型的细胞模型，P＜0.01。 5、应用乳酸检测试剂盒，G单倍型的细胞模型产生乳酸的量低于B4单倍型细胞模型，P＜0.01。 6、检测B4，G两单倍型细胞模型的细胞活性，低氧环境下的两细胞模型活性相对于常氧均有下降，无统计学差异，但G单倍型细胞模型活性低于B4单倍型细胞模型，P＜0.05。 7、加入糖酵解抑制剂2-DG后，B4，G两单倍型细胞模型活性均有显著性降低，P均小于0.001，但G单倍型细胞模型的细胞活性显著低于B4单倍型细胞模型，P＜0.01。 8、对B4，G两单倍型的细胞模型进行ROS产能检测，常氧情况下，G单倍型细胞模型产生的ROS低于B4单倍型，P＜0.05，而低氧情况下，G单倍型细胞模型产生的ROS仍然低于B4单倍型，P＜0.05。 9、在常氧与低氧情况下分别加入线粒体复合体Ⅰ抑制剂Rotenone后检测B4，G两单倍型的ROS水平，常氧情况下两单倍型的ROS水平无差异，低氧情况下，G单倍型的ROS水平显著高于B4单倍型，P＜0.001。 10、常氧情况下加入NAC，检测两单倍型的ATP生成量，G单倍型细胞模型的ATP生成量显著低于B4单倍型，P＜0.01，同时加入NAC及Rotenone后，两单倍型的ATP产生量均有显著性降低，P＜0.001，且G单倍型细胞模型的ATP量降低相对于B4单倍型的更明显，P＜0.01。 11、低氧情况下，同时加入NAC及Rotenone处理细胞后，G单倍型细胞模型的ATP产生量显著低于B4单倍型细胞模型，P＜0.001。 12、应用NAD+/NADH ratio检测试剂盒检测B4，G两单倍型细胞模型的NAD+/NADH ratio，结果显示G单倍型细胞模型的NAD+/NADH ratio显著低于B4单倍型，P＜0.01。 13、加入Rotenone抑制剂后，G单倍型细胞模型产生ATP的量显著低于B4单倍型，同时加入Rotenone和NAM后，ATP产生量均有显著性升高，但G单倍型升高的更为明显，P＜0.001，同时加入Rotenone和FK866后，ATP产生量均有显著性降低，但B4单倍型降低的更为显著，P＜0.001。 结论： 1、根据对B4，G两单倍型细胞模型的复合体酶活性检测，ATP水平检测，由上述的1-4实验结果得出，对于我们所构建的B4，G两单倍型细胞模型，G单倍型细胞模型的线粒体功能要优于B4单倍型细胞模型。 2、通过对B4，G两单倍型细胞模型的乳酸水平检测，低氧条件下细胞活性检测及加入糖酵解抑制剂后对细胞活性的检测，由上述的5-7实验结果，对于我们所构建的B4，G两单倍型细胞模型，G单倍型细胞模型的糖酵解水平低于B4单倍型，且B4单倍型细胞模型更适合在低氧环境下生存。 3、通过对B4，G两单倍型细胞模型的不同条件下ROS水平检测，由上述的8-11实验结果，ROS虽然是能量代谢的主要诱发因子，但对于我们所构建的B4，G两单倍型细胞模型，ROS并不是引起这两种细胞模型代谢改变的诱发因子。 4、由于我们所构建的B4，G两单倍型细胞模型的核背景完全一致，仅线粒体不同，通过对两单倍型的NAD+/NADH ratio检测，及不同条件下改变NAD+/NADHratio检测两单倍型的ATP水平，由上述的12-13实验结果得出，对于我们所构建的B4，G两单倍型细胞模型，NAD+/NADH ratio可能是引起这两种细胞模型能量代谢方式改变的诱发因子，即由氧化磷酸化产能方式改变为糖酵解产能方式。