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背景脑和脊髓是中枢神经系统的重要组成部分,其发育受到严格的调控。在脊髓和大脑皮层的发育过程中,神经元的形态以及迁移都发挥着重要的作用,其时空发育只有得到正确的调节,才能发挥对应的功能。大量研究表明Shh(Sonic hedgehog)能够促进神经前体细胞的增殖,进而影响脊髓以及大脑皮层的发育,但Shh对神经元的迁移以及突起形成是否存在影响尚不清楚。本实验通过过表达Shh,以期研究Shh在脊髓和大脑皮层神经元发育和迁移中的功能。目的1.建立小鼠胚胎脊髓和大脑皮层体外电转后组织片培养技术。2.研究Shh对脊髓发育过程神经元轴突生长及迁移的影响。3.研究Shh过表达对大脑皮层神经元迁移的影响。方法1.取E12和E13.5胚胎小鼠,体外将pCAGGS-GFP质粒分别注入脊髓腔和侧脑室并进行电转,切片培养。48 h后固定染色,观察形态结构以及单个神经元在组织片中的迁移等。2.将Shh过表达载体pCAGGS-Shh转入SH-SY5Y细胞,E12脊髓片以及E13.5大脑皮层,验证Shh能否在细胞-组织-活体三个水平上过表达。3.将GFP和Shh质粒电转入E12小鼠胚胎脊髓腔,切片并培养48 h,染色观察神经元结构;利用子宫内电转技术将GFP和Shh质粒转入E13.5小鼠胚胎室管膜,E16.5取材,固定切片并染色,研究Shh过表达对神经元迁移以及形态是否存在影响。4.将GFP和Shh质粒转染进入SH-SY5Y细胞中,观察GFP阳性细胞的突起伸出情况,随后提取蛋白,通过Western blot检测相关蛋白的表达。结果1.在培养的脊髓片和脑片中能够观察到转染侧GFP阳性细胞,说明该方法能成功的将外源基因转入脊髓以及大脑皮层的神经前体细胞。2.根据SH-SY5Y细胞Western blot结果,脊髓片和大脑皮层免疫荧光染色结果表明,Shh过表达载体能够在细胞-组织-活体中实现Shh过表达。3.Shh在培养了48 h后的脊髓片中过表达后,通过MAP2(Microtubule-associated protein 2)染色以及测量突起长度发现,Shh过表达抑制神经细胞突起的形成。4.通过MAP2,DCX(doublecortin)染色以及统计各层GFP阳性细胞比率发现,Shh过表达抑制E13.5大脑皮层神经元迁移。5.Shh在SH-SY5Y细胞中过表达发现大多数细胞突起变短或变成球状。Western blot结果显示实验组中CyclinD1,c-Myc和PCNA的表达水平明显增加,而黏附相关的N-cadherin的表达水平下降。结论1.建立了小鼠胚胎脊髓及大脑皮层体外电转和组织片培养结合观测神经元变化的技术,为研究小鼠脊髓和大脑皮层发育提供一种有效的方法。2.Shh过表达影响脊髓神经元突起的形成,进而影响脊髓的发育。3.Shh过表达通过抑制大脑皮层神经元的迁移从而影响大脑皮层的发育。