胆管癌是常见的胆道恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年增加趋势。由于胆管特殊的解剖结构使胆管癌细胞容易沿胆管周围血管、淋巴管、神经周围间隙及疏松的结蹄组织生长和转移,呈现跳跃性,所以手术难以根治。加之胆管癌对放疗和化疗不敏感,而肝移植术后复发率又高,所以目前胆管癌的治疗效果难尽人意。 随着分子生物学的长足发展,肿瘤的基因治疗也取得了明显的进展。一些治疗方案已经完成了临床前期的实验,开始了临床的探索。但由于还存在诸如缺乏特效目的基因、基因转移的靶向性差、转导效率还比较低,以及转移基因的体内表达还缺乏有效的调控手段等问题,基因治疗还谈不上替代现行的常规手段。加之恶性肿瘤的发生是多基因协同作用、多因素参与和多阶段综合发展的结果,只靠矫正一到二种内源性基因的突变是很难取得满意疗效的,毒副作用也很难控制。所以人们把目光转向外来物质。最近报道的凋亡素就具有巨大的潜力,它是来源于鸡贫血病毒,是该病毒的功能蛋白,能引起鸡胸腺细胞和骨髓成红细胞的凋亡。人们将之通过基因手段导入人体细胞,发现它能引发肿瘤细胞和转化细胞的凋亡,而对正常的细胞无此作用,并且长期表达于正常细胞没有观察到细胞转化和死亡。所以我们选择凋亡素作为研究对象,通过分子生物学手段将其导入胆管癌细胞中,观察它的效用和可能的机制,并通过体外、体内实验了解它对胆管癌是否具有治疗作用,以期探索胆管癌新的治疗手段。 本实验我们通过PCR获得凋亡素基因,运用T4连接酶将它与PGEM-T Easy质粒连接,通过测序证实为全长凋亡素基因后与带荧光蛋白基因和CMV启动子的质粒连接。然后运用Adeasy-1系统构建含荧光蛋白基因和凋亡素基因的腺病毒DNA,通过在293细胞内大量扩增后,运用氯化铯纯化和浓缩后制成高浓度的腺病毒。再用腺病毒感染胆管癌细胞株,用TUNEL染色了解凋亡素基因是否导致胆管癌细胞株的凋亡,同时观察Bcl-2蛋白的表达情况。最后运用腺病毒治疗裸鼠种植性胆管癌,了解凋亡素是否具有治疗作用及相关副作用。 主要的结果及结论如下: 1、通过酶切和测序证实成功构建含凋亡素基因的PGEM-T Easy-VP3质粒和含荧光蛋白基因及凋亡素基因的Padtrack-CMV-VP3质粒。便于永久保存。然后运用同源