研究背景和目的：恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,近几年其发病率还在呈不断上升之势,而目前应用于癌症临床治疗的手术、放疗、化疗等方法难以从根本上防治肿瘤。因此,探索肿瘤治疗新方法和技术是当前生命科学和医学的研究热点和亟待解决的重大问题。1989,日本学者Umemura S等人首次提出一种利用超声结合声敏剂联合抗肿瘤的新方法,并称之为声动力学疗法(Sonodynamic Therapy, SDT)。SDT是指对肿瘤患者静脉注射一定剂量的声敏剂,如血卟啉及其衍生物等,然后用一定频率和强度的超声照射肿瘤部位,使聚集在肿瘤部位的声敏剂产生抗肿瘤因子杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长,达到治疗肿瘤的目的。由于声敏剂的无毒或低毒性及其在肿瘤组织的聚集性,加之超声的可聚焦性、穿透性和照射部位的选择性,与单纯超声相比,SDT在降低了单纯超声致细胞死亡的强度阈值的同时,特异性地杀伤肿瘤细胞而避免对周围正常组织的损害。尤其对一些难于手术、深部组织肿瘤治疗或需静脉化疗的患者,SDT具有较强的靶向性、安全性和微创性,因此SDT抗肿瘤研究具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。SDT作为抗癌研究另辟蹊径的新探索,涉及生物、医学、物理和化学诸多领域,在肿瘤治疗方面有多学科交叉的优势,但也增加了研究的难度和复杂性。尽管国内外相关学者从不同学科角度开展了许多基础研究,但由于SDT抗癌系统的多因素和复杂性,目前关于SDT抗肿瘤的作用机制仍无定论。本研究是在前期实验中发现SDT可诱导肿瘤细胞凋亡和细胞自噬现象的工作基础上,追踪近年凸显的细胞自噬研究热点及其在SDT抗肿瘤研究尚无报道的动态,利用对正常细胞安全的低强度聚焦超声和对细胞低毒、抑癌效果明显且有特殊亚细胞定位特性的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)为声敏剂,选用在体、离体培养的小鼠腹水型肿瘤细胞S180, H-22, EAC和白血病细胞L1210为细胞模型,通过多种现代细胞分子生物学研究手段和技术,从显微结构、超微结构和分子水平不同层次上,研究了声动力学疗法诱导肿瘤细胞的不同死亡模式及差异,重点研究细胞自噬在SDT抗肿瘤中的作用,初步阐明了细胞自噬与细胞凋亡、细胞存活的关系,并探讨了在SDT抗肿瘤研究中如何利用自噬的有利因素增强SDT抗癌疗效,为声动力诱导肿瘤细胞死亡模式及细胞分子生物学机制研究和临床应用提供有价值的理论依据和科学设想。研究方法和结果：1.声敏剂理化属性分析利用紫外和荧光分光光度法对PpⅨ的光谱特性,声致荧光光谱测定,超声空化影响因素等进行研究。结果显示：①不同溶剂中的PpⅨ吸收谱存在差异：PBS缓冲液和1640培养液中不同浓度的PpⅨ吸收谱型基本相似,有5个明显的吸收峰,PpⅨ最大吸收位于36511nm左右；完全培养基和甲醇萃取液中PpⅨ吸收谱相似,当PpⅨ浓度≤20μg/ml时,有一强吸收带出现在402nm处,当PpⅨ浓度升高到40μg/ml时,其强吸收带左移并且呈不规则谱型。②不同溶剂中超声处理对PpⅨ吸收谱的影响不同：在PBS溶液中,超声处理降低了PpⅨ的最大吸收峰值,但对其它二级波峰影响不大；在1640溶液中,超声处理显著降低了PpⅨ最大吸收值,且在542nm处其峰值升高,可能是超声处理PpⅨ产生次级产物在该波长处有较强吸收所致；在完全培养基中超声处理对PpⅨ吸收谱基本没有影响,可能与完全培养基中PpⅨ与血清有较强结合能力,溶液粘滞度高,降低超声空化作用相关。③在PBS和1640溶液中,超声处理后PpⅨ最大荧光发射强度均有所降低,其中在1640溶液中表现更为明显。④采用TA法检测声空化产生羟自由基,研究发现超声空化依赖于超声强度,而不同浓度的PpⅨ对超声产生自由基的影响是先增加后降低,1μg/ml PpⅨ促使超声产生自由基含量增到最大,并且超声空化产生的羟自由基可以被叠氮钠、组氨酸、甘露醇、EDTA和过氧化氢酶不同程度地抑制,而不被SOD所抑制。2.不同腹水型肿瘤细胞对超声敏感性分析以小鼠腹水型肿瘤细胞S180,H-22和EAC为实验模型,比较了不同细胞对低强度聚焦超声应答效应的不同,并从细胞类型、细胞膜特性差异等方面具体分析其可能的影响因素。结果显示：①随处理强度的增加,超声导致不同肿瘤细胞存活率下降的趋势基本一致,尤其S180和H-22细胞存活率的下降趋势非常明显,在辐照强度为3W/cm2存在明显的强度阈值。②超声诱导细胞存活率的降低受到细胞密度效应的影响,高密度细胞表现出一定的‘保护’效应。③三种肿瘤细胞对超声的敏感性依次为S180>H-22>EAC,细胞密度为1×106cells/ml可能是超声辐照离体细胞悬液的一个临界阈值,辐照强度3W/cm2为超声作用S180和H-22肿瘤细胞的强度阈值。不同细胞对超声的敏感性差异可能与肿瘤细胞的组织来源、恶性程度及细胞本身的结构特性等相关。④对不同肿瘤细胞在超声照射后细胞结构敏感靶点的研究中,发现线粒体是低强度超声产生抗癌效应的敏感位点,细胞膜损伤亦是超声导致细胞死亡的主要原因,并且不同肿瘤细胞之间存在差异,其中S180细胞表现最为明显。3.内、外源PpⅨ在肿瘤细胞中的药代动力学变化和定位研究通过荧光分光光度法和激光共聚焦显微镜对内、外源PpⅨ在离体培养S180肿瘤细胞中的代谢和亚细胞定位情况及其动态变化进行研究,利用MTT检测比较在同等实验条件下内、外源性PpⅨ在SDT抗肿瘤中的作用。研究发现：①外源性PpIX在S180肿瘤细胞内的代谢是一个动态变化过程,细胞内PpIX含量在45min达到最高,之后略有下降,60mmin后趋于稳定。②由ALA生成的内源性PpIX (ALA-PpIX)在细胞内的含量随孵育时间延长而逐渐增多,同时释放到胞外的含量也逐渐升高,并且当加入的ALA浓度超过一定阈值时,所生成的内源性PpIX含量不会随ALA浓度升高而增加。③激光共聚焦显微镜观察结果提示外源性PpIX主要分布在细胞膜,内源性PpIX在合成初期主要定位于线粒体,随孵育时间延长,生成的PpIX由线粒体向胞浆逐渐扩散。④选择相同声敏剂浓度(ALA-PpIX和PpIX),用MTT检测比较ALA-SDT和PpIX-SDT对S180肿瘤细胞的损伤作用。结果表明外源性PpIX比内源性PpIX更有利于增强超声的细胞毒作用。4.SDT抗癌效应与细胞膜、线粒体生物学属性变化的分析在优化实验参数的基础上,研究超声结合PpIX对S180肿瘤细胞膜、线粒体结构与功能的影响。实验结果显示：①超声处理后大分子荧光物质FD500在细胞内含量升高,LDH释放到细胞外液中的含量也升高,提示细胞膜通透性增强,胞膜完整性受到破坏,并且声敏剂PpIX显著加剧了超声的作用。②在对细胞膜蛋白的检测中发现SDT处理后即时取材,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性明显降低,唾液酸含量急剧下降,表明膜蛋白结构和功能受损。③超微结构观察证实了细胞膜在SDT处理过程中亦有形态学变化。④研究发现SDT处理后即时细胞内钙离子浓度升高,2h后趋于稳定；质膜电位立即大幅度降低,然后于1h内迅速恢复稳态。其原因是SDT处理一方面破坏了S180肿瘤细胞膜结构的完整性并改变了膜对离子选择性通透的能力,使胞内钙离子浓度升高；另一方面破坏了细胞膜上的糖蛋白结构主要是唾液酸(细胞膜负电荷的主要来源)含量下降,Na+-K+-ATPaes和Ca2+-ATPase舌性降低,促使质膜去极化。⑤细胞内活性氧含量在SDT处理后0.5h显著升高,1h达到最高,然后逐渐下降到正常水平,而细胞内还原性GSH水平在处理后也明显下降(p<0.01),提示声空化产生活性氧自由基在S180细胞损伤中起重要作用。⑥SDT处理后8h, SDT组细胞线粒体膜电位水平极显著降低(p<0.01)；细胞色素C氧化酶活性也明显下降(p<0.01); SDT处理后12h,细胞相对存活率达到最低,提示线粒体结构与功能变化也可能是导致细胞存活能力降低的主要原因之一。5.SDT处理对DNA损伤与细胞周期的影响与对照相比,在单纯PpIX、单纯超声、超声结合PpIX作用于S180细胞的研究中发现：①DNA损伤是细胞受损的早期事件,处理后1h,三个实验组都可诱发S180细胞DNA严重受损,其中超声联合PpIX组表现最为显著。②超声处理后20h, PpIX组和超声结合PpIX组细胞均出现了S期阻滞,40h后阻滞现象基本被解除。推测周期阻滞的原因主要由胞内PpIX引起,超声增强了PpIX在细胞内的富集,所以表现出更明显的S期阻滞,但经过一个细胞周期,胞内PpIX经过代谢使周期阻滞得以解除。6.SDT诱导S180细胞凋亡与细胞自噬研究选择固定SDT参数(1.1MHz,3W/cm2,1min,1μg/ml PpIX),对PpIX-SDT诱导S180细胞死亡过程中是否存在自噬现象以及自噬在细胞存活中的作用进行了研究。结果表明：①通过透射电镜观察、免疫印迹和免疫荧光技术证明了SDT可诱导S180细胞自噬发生,并且自噬发生在SDT作用后的早期阶段,随孵育时间延长逐渐减弱。②细胞凋亡的典型特征如Bax转定位、细胞色素C释放、Caspase-3活化、染色质凝集等呈时间依赖性变化,大约需要4-8h。③利用细胞自噬和凋亡的抑制剂研究自噬在SDT诱导细胞死亡中的作用,结果提示自噬体(AVOs)的形成是细胞凋亡的上游事件,自噬抑制剂3-MA和BaAl增强了SDT对线粒体膜电位的破坏,SDT联合自噬抑制剂特别是BaA1显著增强了SDT诱导Caspase-3活化水平; Caspase抑制剂z-VAD降低了SDT诱导Caspase-3活性的升高,但不能抑制线粒体膜电位变化水平,表明线粒体膜电位下降发生在Caspase上游或者不依赖于Caspase的活化；DAPI染色结果进一步证实了自噬抑制剂有利于促进SDT诱导的S180细胞凋亡,而凋亡抑制剂z-VAD减弱了SDT诱导的细胞凋亡。7.SDT诱导小鼠白血病细胞L1210的不同死亡模式及机制研究实验以小鼠白血病细胞L1210为研究模型,筛选出PpIX-SDT诱导肿瘤细胞发生自噬和凋亡的参数阈值,通过形态学观察、生化分析和分子检测等鉴定细胞自噬和凋亡的典型特征,然后通过抑制剂实验检测细胞自噬与细胞凋亡、细胞存活之间的关系,最后对SDT作用的可能机制进行探讨。其主要研究方法和结果如下：①SDT诱导细胞自噬活性的提高依赖很大范围内PpIX剂量和超声强度,结合细胞存活能力检测结果,选择最佳SDT参数为PpIX浓度1μg/ml,超声强度为1W/cm2。单纯PpIX和单纯超声产生很轻微的细胞毒性作用,而二者的协同作用产生明显抗肿瘤效应,使细胞存活率下降了将近40%。②透射电镜观察证实了自噬体产生；Western blot检测自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ提示细胞自噬活性依赖于SDT处理后的孵育时间,最短检测到自噬发生时间是超声处理后0.5h,且随孵育时间延迟自噬现象减弱；其它自噬相关蛋白Beclin1, UVRAG, VPS34和Lamp2等不同程度的表达增强分析均可证实自噬的发生。③激光共聚焦显微镜观察到的LC3和溶酶体标志蛋白Lamp2、Cathepsin B共定位,进一步证实了在SDT处理后自噬溶酶体的形成。④SDT处理后6h,扫描电镜观察到细胞体积缩小和膜表面起泡现象；DAPI荧光染色显示染色质凝集；与对照组相比,SDT处理组细胞内Caspase-3活性明显增强,且可以被Caspase光谱型抑制剂z-VAD所抑制；PARP作为Capase-3经典底物,其剪切片段(89kDa)也间接证明了Caspase-3活化。⑤免疫荧光和流式细胞仪分析显示,SDT处理后,细胞凋亡的其它特征如线粒体膜电位丧失、Bax/Bak转定位、Bcl-2蛋白表达受损、细胞色素C释放等非常明显并且呈时间依赖性,提示线粒体依赖性凋亡通路在SDT抑制L1210白血病细胞增殖方面起重要作用。⑥抑制剂实验表明SDT诱导细胞内AVOs的形成发生在凋亡的早期；自噬抑制剂3-MA或BaAl增强了SDT诱导的细胞凋亡和细胞存活率的下降；Caspase抑制剂z-VAD抑制了细胞凋亡但并不能最终抑制SDT引发的细胞死亡,提示SDT诱导细胞死亡存在多种模式和途径。⑦SDT处理后受损的线粒体与自噬体标记蛋白LC3和Atg5明显共定位,且可以被自噬抑制剂BaAl所抑制,提示线粒体损伤是细胞自噬启动的诱因之一。而自噬抑制剂BaA1存在时,细胞内Bax的转定位和线粒体膜电位的下降程度均增强,则表明抑制自噬而伴随的细胞凋亡增强与线粒体损伤密切相关。⑧SDT处理后细胞内ROS显著升高,处理后0.5h,加入ROS清除剂NAC在降低ROS水平的同时,发现LC3-Ⅱ表达水平明显降低并且几乎完全抑制了线粒体和Atg5的共定位,从而表明细胞内ROS水平与细胞自噬活性变化有关。⑨DNA损伤是L1210细胞应答SDT作用的早期事件,并且在SDT处理后4h内快速被修复。SDT引发的DNA损伤可以被NAC和线粒体MPTP孔抑制剂CsA所抑制,被自噬抑制剂BaAl增强,由此推测细胞自噬在保护DNA损伤方面有一定作用,可能与自噬清除氧化受损的线粒体维持细胞内代谢平衡相关。⑩ROS清除剂NAC可以部分抑制Caspase-3的活化和PARP的剪切,MTT检测显示NAC保护了SDT诱导的细胞存活能力的下降。结论：1.超声激活PpIX的作用机制与超声空化相关。超声空化可引起PpIX分子结构的变化,可使PpIX的最大吸收强度和最大荧光发射强度降低,其程度与超声作用介质、超声强度以及PpIX浓度有关,合适的PpIX浓度可以增强超声的空化作用,并且超声空化产生高温高压裂解水分子过程中涉及Fenton反应,有H2O2、OH·、O21等分子参与。2.不同细胞由于其结构和功能等方面的差异对超声辐照的敏感性存在差异,研究比较三种小鼠腹水瘤细胞对低强度超声应答效应的敏感性顺序依次为S180>H-22>EAC,这可能与肿瘤细胞的恶性程度以及细胞膜特性差异等因素相关。3.离体培养的S180肿瘤细胞对PpIX有一定的选择性吸收和滞留作用,加药后45min为超声激活PpIX杀伤S180肿瘤细胞的最佳声照处理时间点。外源性PpIX主要定位与细胞膜,内源性PpIX则定位于线粒体,外源性PpIX比内源性PpIX更有利于增强超声对S180的细胞毒效应。4. PpⅨ-SDT诱导细胞死亡的靶位点主要是细胞膜和线粒体,通过超声空化直接产生机械剪切力或间接产生活性氧自由基引发一系列生物学效应,作用于细胞膜的功能蛋白、膜酶和胞内重要细胞器如线粒体等最终导致细胞死亡。5. PpⅨ-SDT导致DNA损伤和细胞周期阻滞,从而在一定程度上抑制肿瘤细胞快速增殖,反映了SDT对肿瘤细胞的多效性。6.在一定实验条件下,PpⅨ-SDT诱导S180细胞凋亡和自噬的发生呈时间依赖性。自噬发生在凋亡之前,细胞自噬本身不足以引发细胞死亡,它在SDT效应中起保护作用,可能与其清除受损线粒体阻止细胞凋亡应答相关。3-MA将细胞自噬阻止在早期阶段,可以通过细胞凋亡和坏死增强SDT诱导的细胞死亡,并且坏死占主要地位。Ba A1将细胞自噬阻止在晚期阶段,也可以增强SDT诱导的细胞死亡,但效果弱于3-MA。因此,无论将细胞自噬阻止在任何阶段,都可以促进SDT诱导的细胞死亡。研究结果为SDT诱导的细胞死亡模式提供新的思路,提示在本研究系统中,SDT联合细胞自噬抑制剂可以增强SDT抗肿瘤疗效。7.由于不同肿瘤细胞对SDT敏感性的差异,研究首先筛选出诱导L1210细胞存活能力降低并且产生自噬现象的最优SDT作用参数组合,自噬发生过程中的关键作用蛋白在SDT处理后呈时间依赖性变化。8.SDT对快速增殖的小鼠白血病细胞L1210有显著的增殖抑制作用,其机制与诱导细胞的线粒体凋亡途径有关。9.SDT作用于离体培养的L1210细胞后,自噬潮出现细胞凋亡的早期,用自噬特异性药物抑制剂可以抑制自噬体的形成,增强SDT诱导的细胞凋亡。10.细胞内活性氧在自噬和凋亡启动过程中起重要作用,并且线粒体损伤和DNA损伤与自噬发生相关。