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研究背景和目的:癌症诱发的死亡率逐年攀升,化学药物治疗(化疗)仍然是目前临床治疗多种癌症的主要手段,但化疗药物通常缺乏靶向性,会对正常组织细胞产生一定的毒副作用,并且长期治疗带来的耐药问题也是造成癌症患者死亡的主要原因之一。大量研究表明化疗联合其他治疗方法(如基因、环氧化酶-2(COX-2)抑制或免疫治疗等)具有协同抗癌疗效,能够有效逆转肿瘤耐药。纳米载体系统在靶向递送化疗药物以及联合其他治疗方法等方面具有独特优势。此外,智能纳米载体能够通过感受肿瘤病灶的内源性刺激(弱酸性条件与还原性环境等)并产生响应来实现药物的可控释放,进而有利于增强药物疗效,降低药物毒副作用。聚(β-氨基酯)(PBAE)是一类可生物降解的阳离子聚合物,具有显著的pH-响应性,能够通过“质子海绵”效应实现药物或基因在肿瘤细胞内的可控释放。本研究通过引入二硫键(S-S)合成了具有pH-与氧化还原-双重响应性的ssPBAE,并以其为材料构建了两种靶向纳米载体系统,用于高效共载、靶向递送与可控释放化疗药物与基因(或COX-2抑制剂),以期实现逆转耐药以及协同增效的抗癌疗效。实验方法:第一部分:1.首先通过迈克尔加成的方法合成了结构单元中含有二硫键的聚(β-氨基酯)(ssPBAE),并通过琼脂糖凝胶电泳考察ssPBAE的氧化还原响应能力。通过二乙烯三胺对ssPBAE进行胺基化修饰制备胺基化的ssPBAE(NH-ssPBAE)。化疗药物甲氨蝶呤(MTX)与NH-ssPBAE通过酰胺键相连合成聚合物前药ssPBAE-MTX。利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)与核磁共振氢谱(~1HNMR)对ssPBAE-MTX进行结构表征。利用紫外分光光度计测定ssPBAE-MTX中MTX的载药量,而后ssPBAE-MTX聚合物前药通过静电吸附作用负载质粒DNA(pDNA),制备ssPBAE-MTX/pDNA纳米复合物。随后采用电荷吸附将具有肝癌靶向性以及电荷翻转能力的羧基化普鲁兰多糖衍生物(CAPL)包覆于纳米复合物表面,制备CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系。利用透射电子显微镜(TEM)考察CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系的形貌,利用纳米粒度分析仪考察纳米共载体系的粒径、聚合物分散指数(PDI)与Zeta电位,通过动态透析方法考察纳米共载体系的pH/氧化还原响应性释药性能。2.利用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)考察CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系在人源肝癌细胞系HepG2内的细胞摄取以及溶酶体逃逸性质,通过CCK-8细胞毒性实验考察CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系对人源肝癌细胞系HepG2的细胞增殖影响。第二部分:1.以ssPBAE与PLGA作为载体材料,通过超声乳化溶剂挥发法制备共载疏水性药物阿霉素(DOX)与选择性COX-2抑制剂塞来昔布(CXB)的ssPBAE/PLGA/DOX/CXB(PPDC)纳米核。通过电荷吸附作用将透明质酸(HA)包覆于PPDC纳米核表面,得到HPPDC纳米共载体系。利用TEM对HPPDC纳米共载体系的形貌进行表征,并使用纳米粒度分析仪检测其粒径、PDI和Zeta电位。采用高效液相色谱法(HPLC)测定DOX和CXB在HPPDC纳米共载体系中的载药量和包封率,并采用动态透析方法考察纳米共载体系的pH/氧化还原响应性药物释放性能。2.在细胞水平考察HPPDC纳米共载体系逆转耐药性质:选取对DOX敏感的人乳腺癌MCF-7细胞系与对DOX不敏感的人乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞系,对比考察了HPPDC纳米共载体系的入胞性能、细胞内释放药物的能力、细胞毒性作用和诱导细胞凋亡能力。然后选取MCF-7/ADR耐药细胞系考察HPPDC纳米共载体系在mRNA水平对MDR1基因表达的影响,以及对COX-2与P-gp蛋白表达水平的影响。3.构建MCF-7/ADR荷瘤BALB/c裸鼠模型,并对HPPDC纳米共载体系进行Cy5.5近红外探针标记。尾静脉注射给药后,采用体内荧光成像技术考察HPPDC-Cy5.5纳米共载体系的组织分布与肿瘤蓄积性质,以评价共载体系的体内靶向性能。随后考察HPPDC纳米共载体系对MCF-7/ADR荷瘤BALB/c裸鼠的体内抗肿瘤效果,包括对肿瘤生长的抑制作用及其对化疗药物的减毒作用。实验结束后处死小鼠并摘除其肿瘤组织,从肿瘤组织的mRNA和蛋白水平进一步考察HPPDC纳米共载体系对COX-2和P-gp蛋白表达的影响。研究结果:第一部分:1.成功制备含有二硫键的ssPBAE,并且琼脂糖凝胶电泳实验结果显示ssPBAE具有良好的氧化还原响应能力。二乙烯三胺对ssPBAE进行胺基化修饰得到NH-ssPBAE;MTX的γ-羧基与NH-ssPBAE的胺基通过酰胺反应合成聚合物前药ssPBAE-MTX;红外光谱与核磁共振氢谱结果证实MTX成功与NH-ssPBAE相连。ssPBAE-MTX聚合物前药中MTX的载药量为6.24±0.45%。ssPBAE-MTX能够通过电荷作用负载pDNA,形成ssPBAE-MTX/pDNA纳米复合物,具有良好的体外稳定性。普鲁兰多糖衍生物CAPL通过静电吸附作用成功包覆于ssPBAE-MTX/pDNA纳米复合物表面,获得CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系。CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系粒径约为120nm,分布均匀,具有明显的“核-壳”结构。此外,纳米共载体系在肿瘤微环境的体外模拟条件下表现出显著的pH与氧化还原双重响应性释药能力。2.通过去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导的内吞作用,CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系可有效地被人肝癌细胞HepG2摄取,实现基因和化疗药物的协同递送。肿瘤细胞内涵体/溶酶体的弱酸性条件高效触发CAPL的电荷翻转与ssPBAE的“质子海绵”效应,从而促进CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系成功从内涵体/溶酶体逃逸到细胞质中。然后在细胞质的高谷胱甘肽环境中,二硫键发生断裂并诱导ssPBAE降解,从而进一步触发pDNA和MTX的释放,发挥其对肝癌的协同治疗作用。第二部分:1.为优化载体性质并达到控释的目的,将ssPBAE与PLGA混合并通过超声乳化溶剂挥发法制备得到共载DOX与CXB的PPDC纳米核。PPDC纳米核具有均一的球形形貌和密实的内部结构,粒径约为114nm,PDI较小,呈现出高正电性,Zeta电位约为 38mV。HA通过静电吸附作用包覆于PPDC纳米核表面,得到HPPDC纳米共载体系。HPPDC纳米共载体系呈均一球形,具有明显的“核-壳”结构,粒径约为212.6nm,PDI较小。PPDC纳米核中DOX和CXB的载药量分别为3.92%和7.98%;HPPDC纳米共载体系中DOX和CXB的载药量分别为2.15%和4.02%;在两种纳米载体系统中DOX与CXB的包封率均高于70%。HPPDC纳米共载体系具有良好的体外稳定性,且在体外模拟癌细胞内溶酶体pH和谷胱甘肽微环境下,表现出显著的pH与氧化还原双重响应性药物释放性能。2.据报道CXB能够通过抑制肿瘤细胞中多药耐药(MDR)相关蛋白P-gp的表达,进而逆转肿瘤MDR。研究证实P-gp的高表达是人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR的主要耐药机制,并且该细胞系特征性地高表达CD44。HPPDC纳米共载体系能够通过HA与CD44高亲和性介导的内吞作用被MCF-7/ADR细胞有效摄取;入胞后通过对内涵体/溶酶体的弱酸性条件与胞内还原性环境的先后响应释放CXB与DOX,分别发挥COX-2抑制效应与细胞毒作用。在MCF-7/ADR细胞中,HPPDC纳米共载体系表现出高效的杀伤作用与细胞凋亡诱导效应,并且显著地下调了P-gp的mRNA与蛋白表达。3.成功构建了MCF-7/ADR荷瘤裸鼠模型。经尾静脉注射后,HPPDC-Cy5.5纳米共载体系表现出良好的肿瘤靶向性,能够通过EPR效应与HA/CD44介导的主动靶向作用有效递送药物至肿瘤病灶并促进药物在肿瘤部位的蓄积。HPPDC纳米共载体系显著抑制了MCF-7/ADR肿瘤的体内生长,提高了DOX的抗肿瘤疗效,并且明显降低了肿瘤组织中COX-2和P-gp的蛋白表达。此外,HPPDC纳米共载体系对荷瘤小鼠体重及其正常器官组织未造成明显的影响。结论:本研究合成了具有pH与氧化还原双重响应性的ssPBAE,并以其为材料构建了两种智能响应性纳米共载体系(CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA与HPPDC)。CAPL/ssPBAE-MTX/pDNA纳米共载体系能够促进基因与化疗药物DOX的高效入胞及其在胞内的可控释放,表现出对肝癌的化疗增敏效应。HPPDC纳米共载体系具有良好的乳腺癌靶向性能,表现出对MDCF-7/ADR耐药肿瘤体内外生长的高效抑制效率,能够通过下调COX-2与P-gp的表达逆转乳腺癌耐药。可见,基于ssPBAE的纳米载体系统具有显著的pH与氧化还原双重响应性,可用于不同作用机制抗肿瘤药物的高效共载、靶向递送与可控释放,在肿瘤联合治疗方面具有独特的优势与巨大的应用潜力。