第一章 简述了荧光分析法的原理及其发展,尤其是结合激光扫描共聚焦显微镜和双光子成像技术的优势、菁染料的基本结构及光学性能：着重总结了近年来菁染料荧光探针在细胞内活性物质检测方面的研究进展。第二章将乙烯键桥链吲哚衍生物和喹啉利用一步缩合法,合成了一种比率发射荧光探针(QVBI)用于极度酸性测定,并采用核磁滴定对其响应机理进行了研究。QVBI具有强的pH依赖行为,其发射比率(F522nm/F630nm)对极度酸性(pH 3.8-2.0)高度敏感。比率发射型荧光探针能够抵消环境变化、探针分布差异以及仪器的波动等可能对测定带来的影响,从而提供更准确的测量。此外,表征了该探针其他光学性质,如高的荧光量子产率(0.89)、大的Stokes位移(110 nm)、好的选择性、极高的光稳定性和低的细胞毒性。动态荧光成像显示QVBI具有优良的细胞膜通透性。采用激光共聚焦扫描显微技术,成功实现了E.coli细胞内极度酸性的比率测定。因此,QVBI适用于极度酸性pH的检测。第三章通过乙烯键桥链吲哚衍生物和吡啶合成了一个荧光pH探针PVBI,采用质谱和核磁共振波谱对其结构进行了表征,并用含时密度函数理论对PVBI与H+响应机理进行了研究。PVBI的荧光强度与pH在3.0-4.6范围内呈良好的线性关系,pKa值为3.87。该探针对H+具有高的敏感性和选择性响应、好的光稳定性和可逆性。更重要的是PVBI有优良的细胞膜通透性并成功地应用于细胞内pH成像。第四章利用丁二烯桥链苯并吲哚衍生物和3-[3-(4-氟苯基)-1-烷基-1H-吲哚合成了一个基于分子内电荷转移效应的不对称菁染料pH荧光探针。采用质谱和核磁共振波谱对其结构进行了表征。紫外和荧光滴定显示,该探针具有较低的pKa值(2.89),适用于极度酸性的测量;对H+有较高的灵敏度、好的选择性、以及超大的Stocks位移(145 nm)。由于该探针溶液在结合H+前后颜色变化明显，可作为比色pH探针。该探针可穿透细胞膜,已成功的应用于E.coli细胞间隔极度酸性pH值的检测和成像。第五章采用简便的方法合成了一种半花菁双光子荧光探针ASMI,它能对半胱氨酸进行灵敏、快速、高选择性的比率传感,并特异性靶向线粒体,成功实现对活细胞和深度150 μm的组织中的半胱氨酸比率成像。ASMI由一个具有高的双光子活性和生物相容性的部花菁作为荧光团,丙烯酰氧基作为硫醇的反应基团,半胱氨酸首先与丙烯酰氧基共辄加成生成硫醚,然后分子内环化产生部花菁荧光团和一个7元环酰胺。ASMI不仅有线粒体特异靶向能力,而且在生理pH值与Cys反应后表现出了蓝到绿的荧光发射改变。重要的是,ASMI和部花菁均显示出很好的生物相容性和非常大的双光子吸收横截面积(Φσ-max),它们分别为65.2 GM(λex=740 nnm)和72.6 GM(λex=760 nm),能够提供很好的比率型双光子荧光成像。该探针已经被成功的应用于活细胞和活体组织切片线粒体Cys的双光子成像研究。因此,作为一个比率型双光子线粒体Cys选择性荧光探针,对生物体中Cys的检测具有重要意义。第六章利用一个吡啶基的半花菁作为荧光团,7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)为硫醇的响应基团设计合成了一个Turn-on型生物硫醇荧光探针MCY-NBD,NBD同时也是荧光猝灭基团,MCY-NBD具有非常低的荧光量子产率。该探针在接近生理pH值范围(6.0-7.5)内对硫醇具有高灵敏和快速响应(2 min),荧光强度增加约8-9倍,并且具有好的光稳定性和对生物硫醇高的选择性响应。我们通过高分辨质谱对MCY-NBD与硫醇反应前后的物质进行了分析,提出了探针的传感机理。该探针优良的光学性能有望应用于生物体内硫醇的选择性检测。