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目的：肺癌是病发率及病死率极高的恶性肿瘤,其中肺腺癌是最常见的病理亚型,其主要特点表现为发病机制复杂、侵袭性强、患者预后差等。近年来肺腺癌患者的五年生存率不超过20%,并且许多患者死于手术后的转移性复发。因此,对于肺腺癌转移的治疗发现新的预后生物标志物至关重要。肿瘤微环境是复杂的集成系统,相关免疫细胞可以通过分泌因子改变其微环境从而对肿瘤细胞行为进行调控。研究表明,肿瘤微环境中免疫细胞类型、密度、浸润程度等免疫学参数与患者临床治疗及预后相关。上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition,EMT）在肿瘤转移中起着重要作用,经历EMT的上皮细胞发生转变呈现出间充质细胞表型,增强肿瘤的侵袭和迁移能力,从而导致癌症恶性发展。蛋白酪氨酸磷酸酶受体N（Protein Tyrosine Phosphatase Receptor-type N,PTPRN）是一种I型跨膜蛋白,参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡及迁移调控,已被证明在多种癌中高表达并且与不良预后相关。基于以上背景,本研究主要探讨PTPRN在肺腺癌中的作用以及其与肿瘤转移和免疫浸润之间的关系。A研究方法：1.A免疫组织化学实验检测PTPRN在40例肺腺癌患者临床样本中的表达情况,根据免疫组化评分的中值将样本分为PTPRN高、低表达组,通过Kaplan-Meier生存分析阐述PTPRN与肺腺癌患者不良预后的关系。2.选用人肺腺癌细胞株A549和H1299进行PTPRN质粒转染,蛋白质印迹法用于检测转染后目的蛋白PTPRN的过表达情况,细胞划痕试验和transwell试验用于检测PTPRN高表达对肺腺癌细胞的迁移能力的影响。3.通过生物信息学分析以确定PTPRN在来自癌症基因组图谱（TCGA）的肺腺癌患者数据中的表达情况,以及PTPRN与肺腺癌患者转移及总体生存率之间的关系。Cox比例风险回归模型评价PTPRN对患者预后的价值。4.通过基因集富集分析（GSEA）发现PTPRN高表达组与EMT途径和PI3K/AKT/m TOR通路具有显著富集关系,采用蛋白质印迹法检测PTPRN过表达对EMT标志物N-cadherin、E-cadherin和Vimentin,以及PI3K/AKT/m TOR通路相关蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT和Cyclin D1的表达调控作用。5.GSEA和SIBERSORTx用于分析PTPRN与不同肿瘤浸润性免疫细胞之间的相关性,综合基因表达谱数据动态分析（GEPIA）的“correlation”模块分析结果,选取与PTPRN尤为相关的自然杀伤（NK）细胞进行下一步验证。6.从健康人外周血中提取NK细胞,通过流式细胞术测定CD3-CD56+细胞百分比进行表型鉴定,乳酸脱氢酶测定和酶联免疫吸附测定用以检测NK细胞的杀伤活性。7.选用小鼠肺腺癌细胞系LLC进行电转染构建稳定PTPRN高表达细胞株,皮下注射到balb/c小鼠腋下构建小鼠肺腺癌荷瘤模型,免疫组织化学实验检测小鼠肿瘤组织中EMT标志物Vimentin及小鼠NK细胞的抑制标志物KLRA1的表达。结果：1.临床样本证明PTPRN高表达与肺腺癌不良预后有关:根据40例肺腺癌患者样本切片的免疫组织化学评分中值和ROC曲线（AUC=0.727,P=0.0019）,将样本分为低表达组（≤2）和高表达组（＞2）进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示PTPRN高表达组与低表达组相比,肺腺癌患者生存期显著降低（P=0.0257）。2.PTPRN高表达促进肺腺癌细胞的迁移:western blotting结果显示与阴性对照组相比,转染质粒的A549和H1299内PTPRN表达均显著上调（P＜0.01,P＜0.001）。对成功构建的过表达细胞株进行细胞迁移能力测定,细胞划痕试验结果显示,与阴性对照组相比,两株细胞的PTPRN过表达组24 h后细胞愈合面积均显著性增大（A549,P＜0.0001;H1299,P＜0.0001）。Transwell试验结果同样显示,36 h后PTPRN高表达组迁移细胞数显著增多（A549,P＜0.05;H1299,P＜0.01）。3.PTPRN高表达与肺腺癌转移有关,且可作为肺腺癌患者总生存期差的独立预后因素:TCGA RNA Seq数据表明,与非癌组织样本相比,PTPRN在肺腺癌中显著过表达（P＜0.05）,此外,与非转移性肺腺癌患者相比,PTPRN在肺腺癌远处转移及淋巴结转移患者中高表达（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析显示PTPRN高表达组肺腺癌患者的总生存期显著低于低表达组（P＜0.0001）。单因素分析表明,晚期病理分期（III-IV期）、肿瘤分期（T3-T4期）、区域淋巴结转移（N1-N3）、远处转移及PTPRN高表达会导致肺腺癌患者的不良预后,多因素分析证实PTPRN高表达是肺腺癌患者总生存期差的独立预后因素（P=0.036）。4.PTPRN在肺腺癌中与EMT途径和PI3K/AKT/m TOR信号通路相关:GSEA结果显示PTPRN高表达样本在EMT及PI3K/AKT/m TOR信号通路显著富集,TCGA RNA Seq数据也显示PTPRN高表达组EMT标志物N-cadherin、Slug、Snail、Twist和Vimentin的表达显著高于低表达组（P＜0.001）。western blot结果证实A549和H1299中PTPRN过表达组Vimentin和N-cadherin的表达水平较阴性对照组均显著增加（P＜0.01）,同时上皮标志物E-cadherin表达水平显著降低（P＜0.01）,另外通路蛋白检测发现p-ERK1/2,p-AKT和Cyclin D1的表达在PTPRN过表达组显著上调（P＜0.05）。5.PTPRN参与肺腺癌中的免疫反应,且与NK细胞抑制性受体相关:GSEA发现PTPRN高表达与多种免疫相关途径存在富集关系,免疫分数计算结果显示PTPRN与Immune Score呈负相关（P=0.0108）。CIBERSORTx和GEPIA分析结果表明PTPRN可能在调节肿瘤浸润免疫环境的T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞和NK细胞中起关键作用,且与NK细胞抑制性受体显著相关（KIR2DL3,P＜0.05;KIR2DL4,P＜0.0001;KIR3DL3,P＜0.01）。6.PTPRN抑制NK细胞的杀伤活性:TCGA中肺腺癌数据集分析结果显示与PTPRN低表达组相比,NK细胞抑制性受体LIRB1和KLRC1在PTPRN高表达组中的表达显著增加（LIRB1,P＜0.01;KLRC1,P＜0.05）。乳酸脱氢酶测定结果显示在A549和H1299中PTPRN过表达会显著抑制NK细胞杀伤活性（P＜0.05）,酶联免疫吸附测定结果同样发现PTPRN过表达组NK细胞分泌因子IFN-γ和TNF-α的水平显著降低（P＜0.05）。7.PTPRN在体内影响EMT及NK细胞抑制标志物:Balb/c小鼠皮下注射转染PTPRN质粒的LCC细胞,成功构建肺腺癌荷瘤小鼠模型。与阴性对照组相比,PTPRN过表达组的肿瘤大小显著增加（P＜0.05）。肿瘤组织切片的免疫组化结果显示PTPRN上调了EMT标志物Vimentin及小鼠NK细胞抑制标志物KLRA1的表达,且TGF-β与PTPRN对Vimentin的表达上调具有协同作用。结论：1.PTPRN可作为肺腺癌患者的潜在预后标志物并预测患者转移状态。2.PTPRN影响免疫细胞尤其是NK细胞的浸润,可作为在肺腺癌治疗中调节抗肿瘤免疫反应的新型治疗靶点。